CD160通過調(diào)控結(jié)直腸癌中CD8+ T細(xì)胞耗竭決定抗PD-1免疫治療耐藥性

   結(jié)腸發(fā)生腫瘤的傾向性高于回腸，但免疫微環(huán)境差異在此現(xiàn)象中的作用尚不明確。本研究通過比較結(jié)直腸癌（CRC）患者和健康供體的配對(duì)回腸與結(jié)腸樣本，發(fā)現(xiàn)回腸富集的CD160+CD8+ T細(xì)胞具有未被認(rèn)知的特征：包括終末耗竭抗性和強(qiáng)大的克隆擴(kuò)增能力。轉(zhuǎn)移CD160+CD8+ T細(xì)胞可顯著抑制微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H）和炎癥誘導(dǎo)的CRC模型中的腫瘤生長(zhǎng)。Cd160基因敲除會(huì)加速腫瘤生長(zhǎng)，而回輸CD160+CD8+ T細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。值得注意的是，在MSI-H且抗PD-1耐藥的CRC模型中，CD160+CD8+ T細(xì)胞通過增加腫瘤浸潤(rùn)性祖細(xì)胞耗竭T細(xì)胞，顯著提升抗PD-1療效并克服耐藥性，幾乎完全清除腫瘤。機(jī)制上，我們發(fā)現(xiàn)CD160與PI3K（p85α）的相互作用通過AKT–NF-κB通路促進(jìn)FcεR1γ和4-1BB表達(dá)，從而增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞毒性。本研究揭示CD160是CD8+ T細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)控因子，并提出轉(zhuǎn)移CD160+CD8+ T細(xì)胞這一創(chuàng)新免疫治療策略以克服抗PD-1耐藥。本文于2025年9月發(fā)表于《Nature Cell Biology》，IF: 19.1。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.單細(xì)胞免疫圖譜揭示配對(duì)回腸、結(jié)腸及結(jié)直腸腫瘤的系統(tǒng)性差異

   為構(gòu)建免疫細(xì)胞圖譜，我們獲取了68例CRC患者和健康供體配對(duì)樣本中CD45+免疫細(xì)胞的scRNA/BCR/TCR測(cè)序數(shù)據(jù)，包括腫瘤引流淋巴結(jié)（LNs）、外周血單核細(xì)胞（PBMCs）、回腸、結(jié)腸和腫瘤組織（圖1a）。經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量過濾后，保留465,920個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞。對(duì)多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行批次校正和無監(jiān)督聚類后，我們鑒定出7個(gè)主要譜系，包括4個(gè)淋巴系亞型（T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞和漿細(xì)胞（PCs））及3個(gè)髓系亞型（肥大細(xì)胞、漿樣樹突狀細(xì)胞（pDCs）和其他髓系細(xì)胞）（圖1b）。配對(duì)的BCR和TCR分析結(jié)果與細(xì)胞鑒定高度一致。對(duì)T細(xì)胞的進(jìn)一步亞群聚類發(fā)現(xiàn)了上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）-T細(xì)胞的存在，其在回腸中含量最豐富。

圖1 配對(duì)回腸、結(jié)腸及結(jié)直腸腫瘤的單細(xì)胞免疫圖譜

   各組織間主要細(xì)胞亞群的組成和分布存在顯著差異。PBMCs中富含T細(xì)胞和NK細(xì)胞，腫瘤引流淋巴結(jié)和回腸中富含B細(xì)胞，而腫瘤樣本中髓系細(xì)胞富集，表明不同組織存在異質(zhì)性免疫景觀（圖1c,d）。細(xì)胞毒性及T細(xì)胞活化標(biāo)志物NKG7在回腸和腫瘤組織中的表達(dá)高于結(jié)腸組織（圖1e）。與IEL-T細(xì)胞富集一致，CD160+細(xì)胞比例在回腸中最高，在結(jié)腸和腫瘤中急劇下降（圖1e）。我們還鑒定出TGFB1high長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞（LLPCs）亞群，其在腫瘤和結(jié)腸組織中高度富集（圖1f），這與漿細(xì)胞通過分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β發(fā)揮調(diào)控作用一致。對(duì)跨組織3,188個(gè)PC克隆的BCR克隆匹配分析顯示，同一克隆的PC在腫瘤中TGFB1表達(dá)最高，回腸中最低（圖1g）。回腸來源的PCs具有最高的BCR體細(xì)胞超突變（SHM）頻率，而腫瘤來源的PCs頻率最低（圖1h）。此外，與回腸或結(jié)腸相比，腫瘤來源的B細(xì)胞更傾向于IgG+表型（圖1i），該趨勢(shì)與細(xì)胞亞型組成無關(guān)，進(jìn)一步表明B細(xì)胞在不同組織中可能呈現(xiàn)不同狀態(tài)。髓系細(xì)胞中，單核細(xì)胞在腫瘤組織中積聚而肥大細(xì)胞減少。由于肥大細(xì)胞被激活時(shí)是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵調(diào)控因子，我們構(gòu)建了基因特征來量化肥大細(xì)胞的相對(duì)富集程度，其與CRC預(yù)后顯著相關(guān)（風(fēng)險(xiǎn)比（HR）=0.78，95%置信區(qū)間0.66–0.93）。通過分別對(duì)每個(gè)細(xì)胞譜系進(jìn)行無監(jiān)督層次聚類，我們測(cè)量了跨組織的平均轉(zhuǎn)錄組相似性（圖1j）?？傮w而言，PBMCs和腫瘤引流淋巴結(jié)的免疫細(xì)胞首先被區(qū)分開。所有細(xì)胞譜系中健康供體的組織樣本聚集在一起，表明腫瘤對(duì)周圍正常組織的免疫細(xì)胞狀態(tài)具有顯著影響。但腫瘤樣本呈現(xiàn)高度異質(zhì)性：部分與回腸相似度更高，另一部分則更接近鄰近結(jié)腸組織。

   使用已報(bào)道的基因特征集，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的T細(xì)胞表現(xiàn)出最高的終末耗竭特征，而回腸和結(jié)腸來源的T細(xì)胞顯示最高的IEL特征（圖1k）。通過scTCR-seq將T細(xì)胞克隆與細(xì)胞狀態(tài)關(guān)聯(lián)，我們觀察到IEL-T細(xì)胞在擴(kuò)增克隆中相較于其他T細(xì)胞顯著富集（圖1l）。此外，回腸來源的IEL-T細(xì)胞顯示最高的細(xì)胞毒性活性（圖1k）。為進(jìn)一步探索該關(guān)聯(lián)，我們比較了回腸與結(jié)腸組織中IEL-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)健康供體與CRC患者間存在強(qiáng)相關(guān)性系統(tǒng)差異（圖1m）。除CD160外，回腸中上調(diào)的基因包括T細(xì)胞活化相關(guān)基因（如IFNG、GZMA和GNLY）（圖1m）。通過差異表達(dá)基因（DEGs）的平均表達(dá)對(duì)樣本聚類，發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的IEL-T細(xì)胞高度異質(zhì)：部分樣本的基因特征更接近結(jié)腸樣IEL-T細(xì)胞，另一部分則更接近回腸樣IEL-T細(xì)胞。

2.配對(duì)回腸、結(jié)腸及結(jié)直腸腫瘤中T細(xì)胞狀態(tài)的異質(zhì)性

   為進(jìn)一步探究腫瘤與回腸和結(jié)腸組織相關(guān)的異質(zhì)性，我們比較了GTEx項(xiàng)目中回腸（n=187）和結(jié)腸（n=779）樣本以及癌癥基因組圖譜（TCGA）項(xiàng)目中CRC樣本（n=458）的轉(zhuǎn)錄組相似性。對(duì)免疫相關(guān)基因的無監(jiān)督聚類將CRC樣本分為兩個(gè)簇：一個(gè)與結(jié)腸組織聚為一類（C1），另一個(gè)與回腸組織聚為一類（C2），其中C2的預(yù)后顯著優(yōu)于C1。C2與C1之間的差異表達(dá)基因（DEGs）在T細(xì)胞激活通路中顯著富集，表明回腸與結(jié)腸間不同的T細(xì)胞狀態(tài)在異質(zhì)性腫瘤微環(huán)境（TME）中顯現(xiàn)并影響預(yù)后。為在控制患者間異質(zhì)性的前提下驗(yàn)證這一結(jié)果，我們獲取了健康供體和CRC患者的配對(duì)回腸與結(jié)腸組織，證實(shí)了T細(xì)胞激活的富集現(xiàn)象。

   為表征跨組織異質(zhì)性T細(xì)胞狀態(tài)，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的聚類分析，揭示了6種CD4+ T細(xì)胞狀態(tài)、8種CD8+ T細(xì)胞狀態(tài)以及γδT細(xì)胞（圖2a）。IEL-T細(xì)胞通過經(jīng)典IEL標(biāo)志物表達(dá)及腸道固有層標(biāo)志物CD6缺失進(jìn)行鑒定（圖2a）。具有強(qiáng)IEL特征的γδT細(xì)胞通過TYROBP和TCRγδ基因的額外表達(dá)被識(shí)別，鑒于其與CD8+ T細(xì)胞的高度轉(zhuǎn)錄和功能相似性，將其歸為CD8+ T細(xì)胞群（圖2a）。本研究數(shù)據(jù)集中未檢測(cè)到近期報(bào)道的TCRγδ+ CD8α+ IEL-T細(xì)胞群?？傮w而言，回腸中的CD4+和CD8+ T細(xì)胞顯示T細(xì)胞活化相關(guān)基因上調(diào)，而腫瘤樣本中T細(xì)胞功能障礙相關(guān)基因上調(diào)（圖2b）。

   在CD4+ T細(xì)胞中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和濾泡輔助T細(xì)胞（TFH）在引流淋巴結(jié)和腫瘤樣本中更豐富，而初始T細(xì)胞（TNaive）、中央記憶T細(xì)胞（TCM）和效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）在回腸和結(jié)腸中更豐富，且研究較少的CD4+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（TCTL）在PBMCs和回腸中富集（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3l）。與結(jié)腸和腫瘤相比，回腸表現(xiàn)出相對(duì)較高比例的TEM和TCTL細(xì)胞及較低比例的Treg細(xì)胞，盡管由于隊(duì)列規(guī)模較小，并非所有差異均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在CD8+ T細(xì)胞中（圖2a），記憶T細(xì)胞（TMem）在回腸中更豐富，而類似于先前描述的GZMK+效應(yīng)T細(xì)胞的過渡效應(yīng)T細(xì)胞（GZMK+ eff.）在腫瘤區(qū)域更豐富。為鑒定腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，我們采用基于已報(bào)道的新抗原反應(yīng)性腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞特征的腫瘤反應(yīng)性特征譜，顯示Treg、TFH和TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞處于腫瘤反應(yīng)狀態(tài)。此外，健康供體回腸來源的Treg和TFH細(xì)胞具有最低的新抗原反應(yīng)性評(píng)分，表明腫瘤發(fā)生影響周圍回腸或結(jié)腸的CD4+ T細(xì)胞狀態(tài)。

圖2 健康供體與CRC患者回腸和結(jié)腸組織中T細(xì)胞亞群的免疫特征

   我們隨后測(cè)量了TCGA CRC樣本中129個(gè)預(yù)測(cè)良好預(yù)后的基因在TME內(nèi)主要T細(xì)胞狀態(tài)中的平均表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)（圖2c）。TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞還顯示出最高的T細(xì)胞激活和功能障礙特征。一致的是，C2簇的CRC樣本比C1簇表現(xiàn)出顯著更高的IEL特征。我們從接受一線ICB治療的CRC隊(duì)列中獲取了免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）應(yīng)答者中上調(diào)的基因，并觀察到TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞中的表達(dá)最強(qiáng)（圖2d）。

   我們隨后聚焦于高表達(dá)T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物TIGIT、LAYN、TOX和LAG3的TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞（圖2e）。由于近期研究揭示了耗竭T細(xì)胞的異質(zhì)性狀態(tài)，包括對(duì)ICB應(yīng)答的終末耗竭T細(xì)胞（TTex）和祖細(xì)胞耗竭T細(xì)胞（TPex），我們測(cè)量了單個(gè)細(xì)胞的祖細(xì)胞和終末耗竭CD8+ T細(xì)胞特征。通過跨組織比較，發(fā)現(xiàn)回腸和結(jié)腸來源的TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞表現(xiàn)出顯著更高的祖細(xì)胞耗竭（Exh_Pex）特征評(píng)分，而腫瘤來源的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著更高的終末耗竭（Exh_Tex）評(píng)分（圖2f）。我們還比較了γδT細(xì)胞（既往研究報(bào)道其在結(jié)腸癌中細(xì)胞毒性降低并向終末耗竭狀態(tài)轉(zhuǎn)化），觀察到γδT細(xì)胞在回腸中細(xì)胞毒性最高，在腫瘤中最低（圖2f）。

3.CD160表達(dá)特征揭示CD8+ T細(xì)胞耗竭的狀態(tài)轉(zhuǎn)換

   為研究耗竭T細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換，我們使用Monocle進(jìn)行偽時(shí)間分析以推斷TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞的分化軌跡。分析顯示軌跡始于回腸和結(jié)腸，隨后分化為兩個(gè)富集腫瘤來源T細(xì)胞的分支。軌跡成分1與Exh_Tex特征相關(guān)，成分2與細(xì)胞增殖信號(hào)相關(guān)（圖2g）。沿偽時(shí)間軸，我們觀察到Exh_Tex信號(hào)升高而Exh_Pex信號(hào)降低（圖2g），與既往TPex細(xì)胞產(chǎn)生TTex細(xì)胞的報(bào)道一致。為進(jìn)一步證實(shí)偽時(shí)間早期和晚期的TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞分別對(duì)應(yīng)更偏向祖細(xì)胞和終末耗竭的表型，我們檢測(cè)了經(jīng)典標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。一致地，與更終末耗竭狀態(tài)相關(guān)的EOMES和TOX表達(dá)沿偽時(shí)間逐漸增加，而與祖細(xì)胞狀態(tài)標(biāo)志物IL7R和REL的表達(dá)水平沿偽時(shí)間逐漸降低。我們隨后檢測(cè)了其他非經(jīng)典基因沿軌跡的表達(dá)動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)CD160表達(dá)在所有三種組織中均呈現(xiàn)高度相關(guān)性變化，表明CD160表達(dá)與IEL-T細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換密切相關(guān)（圖2g）。

   CD160已被認(rèn)為是IEL的標(biāo)志物。然而，我們發(fā)現(xiàn)CD160在CD8+ T細(xì)胞亞群中廣泛表達(dá)且表現(xiàn)出強(qiáng)烈的組織特異性（圖2h）。在所有CD8+ T細(xì)胞亞型中，回腸的CD160+ T細(xì)胞比例最高而腫瘤中最低（圖2i），與公共數(shù)據(jù)集一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證CD160的組織特異性表達(dá)，我們使用多重免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)在獨(dú)立CRC樣本中定量CD160+ CD8+ T細(xì)胞，觀察到回腸中比例最高而腫瘤中最低（圖2j-l）。類似地，在C57BL/6小鼠中，小腸（十二指腸、空腸和回腸）的CD160+ CD8+ T細(xì)胞顯著高于結(jié)腸。我們?cè)贏OM/DSS誘導(dǎo)的CRC小鼠中進(jìn)一步證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)回腸CD8+ T細(xì)胞中CD160表達(dá)最高而腫瘤CD8+ T細(xì)胞中最低。這些結(jié)果與我們的scRNA-seq數(shù)據(jù)一致，表明CD160表達(dá)可能受組織局部環(huán)境動(dòng)態(tài)調(diào)控?；啬c和結(jié)腸中CD160+與CD160? CD8+ T細(xì)胞的比較顯示，涉及T細(xì)胞毒性的基因均一致性上調(diào)（圖2m），與已報(bào)道的CD160+ T細(xì)胞溶細(xì)胞效應(yīng)相符。為探究CD160是否表征T細(xì)胞耗竭的狀態(tài)轉(zhuǎn)換，我們比較了單個(gè)效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞（包括TCRαβ+ IEL-T和GZMK+效應(yīng)細(xì)胞）的祖細(xì)胞與終末耗竭特征。CD160表達(dá)與Exh_Pex特征呈正相關(guān)，與Exh_Tex特征呈負(fù)相關(guān)（圖3a）。這些數(shù)據(jù)共同支持CD160表達(dá)與CD8+ T細(xì)胞耗竭狀態(tài)轉(zhuǎn)換的關(guān)聯(lián)性。

圖3 CD8+ T細(xì)胞克隆狀態(tài)轉(zhuǎn)換的譜系追蹤

4.腫瘤耗竭CD8+ T細(xì)胞與CD160? T祖細(xì)胞存在克隆關(guān)聯(lián)

   為評(píng)估IEL-T細(xì)胞克隆狀態(tài)是否因組織而異，我們通過TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞的克隆匹配分析評(píng)估其耗竭特征。值得注意的是，在回腸、結(jié)腸和腫瘤組織間匹配的大多數(shù)TCRαβ+ IEL-T克隆均含有CD160+ T細(xì)胞。雖然從回腸到結(jié)腸及腫瘤的匹配克隆中Exh_Pex特征平均值略有升高，但Exh_Tex特征未顯著增加（圖3b）。我們還比較了與腫瘤TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞克隆匹配的PBMCs和淋巴結(jié)T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)從PBMCs和淋巴結(jié)到腫瘤區(qū)域的克隆中Exh_Tex特征顯著增加（圖3c）。此外，我們觀察到淋巴結(jié)中克隆關(guān)聯(lián)T細(xì)胞的Exh_Pex特征最高（圖3c），這與近期報(bào)道的腫瘤中TTex細(xì)胞源于淋巴結(jié)祖細(xì)胞/干細(xì)胞樣耗竭T細(xì)胞的觀點(diǎn)一致。我們還根據(jù)克隆匹配T細(xì)胞的組織來源對(duì)腫瘤TCRαβ+ IEL-T細(xì)胞進(jìn)行分組。與回腸或結(jié)腸共享克隆的細(xì)胞相比，腫瘤特異性或與PBMCs及淋巴結(jié)T細(xì)胞克隆關(guān)聯(lián)的腫瘤IEL-T細(xì)胞具有顯著更高的Exh_Tex特征和更低的Exh_Pex特征。這些數(shù)據(jù)共同表明，相對(duì)于淋巴結(jié)和PBMCs來源的T細(xì)胞，回腸和結(jié)腸來源的CD160+ CD8+ T細(xì)胞在腫瘤中不易發(fā)生終末耗竭。

   為進(jìn)一步探索CD160與T細(xì)胞耗竭的關(guān)聯(lián)，我們根據(jù)CD160表達(dá)情況比較了腫瘤CD8+ T細(xì)胞的耗竭評(píng)分，發(fā)現(xiàn)CD160? T細(xì)胞比CD160+ T細(xì)胞具有更高的Exh_Tex特征和更低的Exh_Pex特征（圖3d）。該模式在一個(gè)獨(dú)立的CRC scRNA-seq數(shù)據(jù)集中得到進(jìn)一步證實(shí)。接下來，我們使用非腫瘤組織中的所有CD8+ T細(xì)胞定義CD160+和CD160?克隆，并比較與這些細(xì)胞克隆關(guān)聯(lián)的腫瘤CD8+ T細(xì)胞的耗竭特征。與非腫瘤CD160?克隆關(guān)聯(lián)的腫瘤CD8+ T細(xì)胞相比，與非腫瘤CD160+克隆關(guān)聯(lián)的細(xì)胞具有顯著更高的Exh_Pex特征和更低的Exh_Tex特征（圖3e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4o）。由于細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞克隆優(yōu)先擴(kuò)增，我們隨后通過按克隆大小分類T細(xì)胞來檢驗(yàn)CD160是否表征克隆擴(kuò)增。我們注意到在正常組織（而非腫瘤）中，擴(kuò)增克隆內(nèi)CD160+ T細(xì)胞比例逐漸增加（圖3f），表明CD160+ T細(xì)胞在不同組織中具有 distinct 的克隆擴(kuò)增偏好。

   對(duì)所有CD8+ T細(xì)胞單個(gè)克隆進(jìn)行表征后，我們發(fā)現(xiàn)在腫瘤T細(xì)胞主導(dǎo)的最大克隆中Exh_Tex特征較高，而在PBMCs T細(xì)胞主導(dǎo)的克隆中Exh_Pex特征較低（圖3g）?？傮w而言，具有高Exh_Pex特征的克隆明顯由回腸/結(jié)腸主導(dǎo)克隆和淋巴結(jié)主導(dǎo)克隆區(qū)分。我們根據(jù)克隆分布的自然截?cái)嘀祵⒛[瘤CD8+ T細(xì)胞主導(dǎo)的所有克隆分為Exh_Texhi和Exh_Texlo兩組，并分析其與其他組織的譜系關(guān)系（圖3g）。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)Exh_Texlo克隆與其他組織存在譜系關(guān)聯(lián)，而Exh_Texhi克隆主要局限于腫瘤或與淋巴結(jié)CD8+ T細(xì)胞克隆關(guān)聯(lián)。將單個(gè)腫瘤CD8+ T細(xì)胞分為Exh_Texhi和Exh_Texlo兩組后，我們觀察到腫瘤Exh_Texhi細(xì)胞與PBMCs來源的CD8+ T細(xì)胞存在顯著譜系關(guān)聯(lián)，表明這些細(xì)胞未包含在腫瘤CD8+ T細(xì)胞主導(dǎo)的克隆中。另一方面，極少腫瘤Exh_Texhi細(xì)胞與回腸和結(jié)腸的CD8+ T細(xì)胞存在克隆關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果表明TTex細(xì)胞要么是腫瘤特異性的，要么與淋巴結(jié)來源的CD160? CD8+ T細(xì)胞克隆關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組比較表明，健康供體和CRC患者不同組織來源的CD160?CD8? T細(xì)胞保持轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性且不易發(fā)生終末耗竭，而CD160? CD8? T細(xì)胞上調(diào)Exh_Tex特征。在MC38荷瘤小鼠中，脾臟、回腸、結(jié)腸和腫瘤組織中的CD160?CD8? T細(xì)胞比CD160?細(xì)胞表現(xiàn)出顯著更高比例的祖細(xì)胞耗竭細(xì)胞（TCF1+ PD-1+）。這些發(fā)現(xiàn)共同證明，不同組織來源的CD160?CD8? T細(xì)胞具有高度相似的轉(zhuǎn)錄組特征和祖細(xì)胞耗竭表型。

5.CD160界定具有強(qiáng)細(xì)胞毒性和耗竭抗性的CD8? T細(xì)胞亞群

   為評(píng)估CD160+ CD8+ T細(xì)胞功能，我們比較了CD160+與CD160? CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性顆粒表達(dá)。抗CD3/CD28刺激后，CD160+ CD8+ T細(xì)胞的GzmB+比例高于CD160?細(xì)胞（圖4a,b），表明其細(xì)胞毒性更強(qiáng)。為進(jìn)一步研究CD160+ CD8+ T細(xì)胞的耗竭抗性，我們通過持續(xù)抗CD3刺激建立體外慢性刺激模型（該模型誘導(dǎo)耗竭標(biāo)志物PD-1和TIM3上調(diào)）（圖4c），發(fā)現(xiàn)CD160+ CD8+ T細(xì)胞比CD160?細(xì)胞表現(xiàn)出更少的終末耗竭（TIM3+ PD-1+）表型（圖4d,e），證實(shí)其增強(qiáng)的終末耗竭抗性。接下來，我們從MC38-GFP荷瘤小鼠腋窩淋巴結(jié)中分離CD160+和CD160? CD8+ T細(xì)胞并分別擴(kuò)增（圖4f）。與自體腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，CD160+ CD8+ T細(xì)胞組的腫瘤細(xì)胞死亡顯著更高（通過LIVE/DEAD指示染料檢測(cè)）（圖4g,h）。

圖4 CD160+ CD8+ T細(xì)胞具有強(qiáng)細(xì)胞毒性和耗竭抗性，過繼轉(zhuǎn)移可抑制CRC進(jìn)展

   為評(píng)估體內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)情況，我們將CD160+ CD8+ T細(xì)胞（來自GFP小鼠）和CD160? CD8+ T細(xì)胞（來自CD45.1小鼠）共同過繼轉(zhuǎn)移至CD45.2 MC38荷瘤小鼠。轉(zhuǎn)移36小時(shí)后，觀察到腫瘤內(nèi)CD160+ CD8+ T細(xì)胞（GFP+ CD45.1?）的浸潤(rùn)顯著高于CD160? CD8+ T細(xì)胞（GFP? CD45.1+），表明CD160+ CD8+ T細(xì)胞具有增強(qiáng)的腫瘤浸潤(rùn)能力。為評(píng)估腫瘤特異性激活，將分選的CD45.1小鼠來源CD160+ CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至MC38-OVA荷瘤小鼠。在腫瘤浸潤(rùn)的CD45.1+細(xì)胞中，OVA四聚體+細(xì)胞比例隨時(shí)間依賴性增加，表明CD160+ CD8+ T細(xì)胞在TME中被激活并逐漸獲得抗原特異性。

   綜上所述，CD160標(biāo)記了具有細(xì)胞毒性和耗竭抗性的CD8+ T細(xì)胞，其兼具卓越的腫瘤浸潤(rùn)能力和在TME內(nèi)逐步獲得腫瘤抗原特異性的雙重功能優(yōu)勢(shì)。這些發(fā)現(xiàn)表明CD160+ CD8+ T細(xì)胞在CRC腫瘤抑制中起重要作用。

6.過繼轉(zhuǎn)移CD160+ CD8+ T細(xì)胞通過增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞毒性抑制結(jié)直腸腫瘤發(fā)展

   為探究CD160+ CD8+ T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)，我們?cè)贏OM/DSS誘導(dǎo)的CRC小鼠模型中進(jìn)行了過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（圖4i）。與接受PBS的小鼠相比，接受CD160+ CD8+ T細(xì)胞的小鼠腫瘤數(shù)量和大小顯著減少（圖4j-l）。而接受CD160? CD8+ T細(xì)胞的小鼠未顯示抗腫瘤效果。

   接下來通過兩種轉(zhuǎn)移策略評(píng)估CD160+ CD8+ T細(xì)胞在不同腫瘤階段的作用。首先在C57BL/6小鼠接種MC38細(xì)胞的同時(shí)注射CD160+ CD8+ T細(xì)胞以模擬其對(duì)早期腫瘤發(fā)展的影響（圖4m），該組腫瘤體積顯著小于CD160? CD8+ T細(xì)胞或PBS組（圖4n,o）。此外，轉(zhuǎn)移CD160+ CD8+ T細(xì)胞后，觀察到腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D160+CD8+和GzmB+CD8+ T細(xì)胞增加，表明其成功浸潤(rùn)TME并增強(qiáng)CD8? T細(xì)胞毒性（圖4p）。第二種策略在MC38接種7天、腫瘤形成后注射CD160+CD8+ T細(xì)胞，以評(píng)估其對(duì)晚期腫瘤發(fā)展的作用。同樣，CD160+CD8+ T細(xì)胞在維持TME浸潤(rùn)和GzmB表達(dá)的同時(shí)抑制了腫瘤生長(zhǎng)。值得注意的是，兩組實(shí)驗(yàn)中CD160?CD8+ T細(xì)胞均未顯示抗腫瘤效應(yīng)（圖4n）。

   在低免疫原性CT26模型中，盡管CD160+CD8+ T細(xì)胞能浸潤(rùn)腫瘤，但未能抑制腫瘤生長(zhǎng)，表明其抗腫瘤效應(yīng)依賴于腫瘤免疫原性。

7.CD160缺失促進(jìn)CD8+T細(xì)胞終末耗竭并削弱CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤控制

   為探究CD160缺失對(duì)腫瘤控制的影響，我們構(gòu)建了Cd160基因敲除（Cd160?/?）小鼠，并采用AOM/DSS和皮下MC38模型評(píng)估腫瘤進(jìn)展（圖5a,e）。兩種模型中Cd160?/?小鼠均比野生型（WT）小鼠產(chǎn)生更多、更大的腫瘤。值得注意的是，過繼轉(zhuǎn)移同系CD160+CD8+T細(xì)胞可顯著抑制Cd160?/?小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，而CD160?CD8+ T細(xì)胞無治療效應(yīng)（圖5b–d,f,g）。此外，Cd160?/?小鼠腫瘤浸潤(rùn)GzmB+CD8+ T細(xì)胞減少，該現(xiàn)象可通過轉(zhuǎn)移CD160+CD8+ T細(xì)胞得以挽救（圖5h,i）。這些結(jié)果通過腫瘤切片的免疫組化（IHC）得到進(jìn)一步證實(shí)（圖5j,k）。

圖5 CD160缺失加速腫瘤進(jìn)展并促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞的終末耗竭

   我們進(jìn)一步分析了腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞的耗竭表型（祖細(xì)胞型：TCF1+ PD-1+；終末型：TCF1? PD-1+）。Cd160?/?小鼠表現(xiàn)為祖細(xì)胞耗竭CD8+ T細(xì)胞減少而終末耗竭細(xì)胞增多（圖5l–n）。向Cd160?/?小鼠轉(zhuǎn)移CD160+ CD8+ T細(xì)胞可大幅恢復(fù)TCF1+ PD-1+比例而不影響TCF1? PD-1+細(xì)胞比例，而轉(zhuǎn)移相同數(shù)量的CD160? CD8+ T細(xì)胞無此效應(yīng)（圖5l–n）。這些結(jié)果共同表明CD160缺失會(huì)削弱CD8+ T細(xì)胞毒性、加速CRC進(jìn)展并耗竭抗PD-1應(yīng)答的祖細(xì)胞耗竭T細(xì)胞，支持CD160+ CD8+ T細(xì)胞在改善抗PD-1免疫治療方面的 therapeutic potential。

8.過繼轉(zhuǎn)移CD160+ CD8+ T細(xì)胞賦予MSI-H CRC抗PD-1免疫治療敏感性并克服耐藥性

   我們隨后評(píng)估了轉(zhuǎn)移CD160+ CD8+ T細(xì)胞是否能增強(qiáng)抗PD-1在MC38腫瘤中的療效（圖6a）。出乎意料的是，CD160+ CD8+ T細(xì)胞聯(lián)合抗PD-1治療可誘導(dǎo)近乎完全的腫瘤消退，效果優(yōu)于任一單藥治療，而CD160? CD8+ T細(xì)胞未能增強(qiáng)抗PD-1療效（圖6b,c）。CD160+ CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤后增加了GzmB+ CD8+ T細(xì)胞比例，聯(lián)合組尤為顯著（圖6d）。

圖6 腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D160+ CD8+ T細(xì)胞賦予免疫治療敏感性并克服MSI-H CRC的抗PD-1耐藥

   通過促使耗竭平衡向祖細(xì)胞耗竭T細(xì)胞傾斜以阻斷抗PD-1治療期間終末耗竭CD8+ T細(xì)胞的積聚對(duì)改善應(yīng)答至關(guān)重要。我們發(fā)現(xiàn)CD160+ CD8+ T細(xì)胞單藥或聯(lián)合抗PD-1治療均能顯著提高腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞中TCF1+ PD-1+百分比，且不影響TCF1? PD-1+水平（圖6e）。多重IHC進(jìn)一步證實(shí)，單用CD160+ CD8+ T細(xì)胞或聯(lián)合抗PD-1治療的小鼠中祖細(xì)胞耗竭CD8+ T細(xì)胞增加（圖6f,g）。在AOM/DSS誘導(dǎo)的CRC小鼠中，單用抗PD-1無明顯療效，但聯(lián)合CD160+ CD8+ T細(xì)胞可顯著降低腫瘤負(fù)荷。此外，單用CD160?CD8? T細(xì)胞未能延長(zhǎng)生存期，但與抗PD-1聯(lián)用后可適度改善生存。

   盡管抗PD-1免疫治療對(duì)MSI-H型CRC患者具有良好療效，但約50%此類患者存在抗PD-1耐藥。為進(jìn)一步確認(rèn)CD160與抗PD-1應(yīng)答的關(guān)系，我們收集了13例接受抗PD-1治療的MSI-H型CRC患者。根據(jù)腫瘤退縮等級(jí)（TRG）定義應(yīng)答：敏感組（TRG <2，n=8）與耐藥組（TRG ≥2，n=5）（圖6h）。CT掃描證實(shí)敏感組抗PD-1治療后原發(fā)腫瘤持續(xù)緩解，而耐藥組存在較大殘留腫瘤（圖6i）。確實(shí)，我們觀察到敏感組腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞中CD160表達(dá)顯著更高（圖6j,k）。一致地，在獨(dú)立接受一線ICB治療的CRC隊(duì)列中，CD160高表達(dá)預(yù)示改善的生存期（圖6l），且該效應(yīng)獨(dú)立于CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)。完全緩解者CD160表達(dá)更高，盡管因隊(duì)列規(guī)模較小未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

   為進(jìn)一步探究CD160+ CD8+ T細(xì)胞是否能克服MSI-H型CRC的抗PD-1耐藥，我們通過多輪抗PD-1治療直至抑瘤效應(yīng)消失，建立了抗PD-1耐藥的MC38腫瘤模型（圖6m–o）。轉(zhuǎn)移CD160+ CD8+ T細(xì)胞可恢復(fù)抗PD-1敏感性，導(dǎo)致腫瘤近乎完全消退（圖6n,o）。該現(xiàn)象伴隨腫瘤浸潤(rùn)GzmB+ CD8+ T細(xì)胞和祖細(xì)胞耗竭T細(xì)胞的增加（圖6p,q）。而CD160? CD8+ T細(xì)胞無此效應(yīng)。這些結(jié)果表明CD160+ CD8+ T細(xì)胞能賦予MSI-H型CRC免疫治療敏感性并克服抗PD-1耐藥。

9.CD160–PI3K相互作用通過促進(jìn)FcεR1γ和4-1BB表達(dá)增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞毒性

   為探究CD160在CD8+ T細(xì)胞中的功能，我們比較了從小鼠脾臟分選的CD160+與CD160? CD8+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。CD160+ CD8+ T細(xì)胞顯示Fcer1g顯著上調(diào)（圖7a），該基因以轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫受體激活信號(hào)而聞名?；虮倔w（GO）富集分析顯示T細(xì)胞激活、NF-κB調(diào)控和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路均上調(diào)（圖7b）。在T細(xì)胞激活通路相關(guān)基因中，參與CD8+ T細(xì)胞存活和記憶形成的CD160下游效應(yīng)分子Tnfrsf9在CD160+ CD8+ T細(xì)胞中高度上調(diào)（圖7c）。

圖7 CD160通過上調(diào)FcεR1γ和4-1BB表達(dá)增強(qiáng)CD8? T細(xì)胞毒性

   在mRNA/蛋白水平上，CD160+ CD8+ T細(xì)胞中Fcer1g（編碼FcεR1γ）表達(dá)顯著更高（圖7d）。在CD160? CD8+ T細(xì)胞中過表達(dá)Cd160可誘導(dǎo)FcεR1γ表達(dá)，而敲低Fcer1g會(huì)降低CD160+ CD8+ T細(xì)胞的GzmB表達(dá)，削弱其細(xì)胞毒性。相反，過表達(dá)Fcer1g可增強(qiáng)CD160? CD8+ T細(xì)胞毒性（圖7e–g）。類似地，CD160+ CD8+ T細(xì)胞中Tnfrsf9（編碼4-1BB）表達(dá)升高，且Cd160過表達(dá)可誘導(dǎo)4-1BB表達(dá)（圖7h,i）。沉默Tnfrsf9會(huì)降低CD160+ CD8+ T細(xì)胞的GzmB水平，而過表達(dá)Tnfrsf9可增強(qiáng)CD160? CD8+ T細(xì)胞毒性（圖7j,k）。同時(shí)，CRC患者和MC38荷瘤小鼠的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D160+ CD8+ T細(xì)胞仍維持顯著高于CD160? CD8+ T細(xì)胞的FcεR1γ和4-1BB表達(dá)。這些結(jié)果表明FcεR1γ和4-1BB是CD160增強(qiáng)CD160+ CD8+ T細(xì)胞毒性的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子。

   我們進(jìn)一步探究了CD160如何調(diào)控CD8+ T細(xì)胞中Fcer1g和Tnfrsf9表達(dá)。NF-κB是Fcer1g和Tnfrsf9的轉(zhuǎn)錄因子，GO分析顯示NF-κB信號(hào)在CD160+ CD8+ T細(xì)胞中富集。與CD160? CD8+ T細(xì)胞相比，CD160+ CD8+ T細(xì)胞上調(diào)了經(jīng)典NF-κB通路（p65）而非非經(jīng)典通路（p52）。免疫熒光及核質(zhì)蛋白印跡顯示NF-κB p65在CD160+ CD8+ T細(xì)胞中發(fā)生顯著核轉(zhuǎn)位，而在CD160? CD8+ T細(xì)胞中未能入核（圖8a–c）。用JSH-23阻斷NF-κB核轉(zhuǎn)位可降低Fcer1g和Tnfrsf9表達(dá)，表明CD160通過NF-κB促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄（圖8d）。

圖8 CD160與PI3K p85α相互作用促進(jìn)NF-κB核轉(zhuǎn)位

   通過基因集富集分析（GSEA）發(fā)現(xiàn)，對(duì)T細(xì)胞激活、增殖、毒性及NF-κB核轉(zhuǎn)位至關(guān)重要的PI3K-AKT通路在CD160+ CD8+ T細(xì)胞中上調(diào)（圖8e），且p-AKT水平升高（圖8f）。I類PI3K是由催化亞基（p110）和調(diào)節(jié)亞基（p85）組成的異二聚體。為確定CD160是否通過與PI3K亞基直接相互作用激活PI3K–AKT通路，我們?cè)贑D160?CD8? T細(xì)胞中進(jìn)行了內(nèi)源性免疫共沉淀（co-IP）。值得注意的是，在相同曝光條件下，CD160與p85α強(qiáng)結(jié)合，與p110δ弱結(jié)合，未檢測(cè)到與p110α、p110β或p110γ的相互作用（圖8g）。該相互作用特異性在共轉(zhuǎn)染HA標(biāo)簽CD160與Flag標(biāo)簽PI3K p85α或p110δ的HEK293T細(xì)胞中得到證實(shí)，其中HA-CD160優(yōu)先結(jié)合p85α。鄰近連接檢測(cè)（PLA）進(jìn)一步揭示CD160?CD8? T細(xì)胞中存在CD160–p85α直接相互作用，而CD160?細(xì)胞中無此現(xiàn)象（圖8h）。分子動(dòng)力學(xué)模擬與對(duì)接分析顯示，CD160–p85α復(fù)合物比其他PI3K亞基復(fù)合物具有更高結(jié)合穩(wěn)定性（圖8i）。功能上，敲低CD160+ CD8+ T細(xì)胞中的p85α?xí)鼵D160介導(dǎo)的GzmB表達(dá)和AKT磷酸化，而敲低p110δ無影響（圖8j,k）。這些發(fā)現(xiàn)共同證明，CD160通過直接與p85α相互作用激活A(yù)KT–NF-κB通路，從而促進(jìn)FcεR1γ和4-1BB表達(dá)，增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞毒性。

結(jié)論

   總之，本研究提供了具有多區(qū)域和克隆分辨率的獨(dú)特CRC患者單細(xì)胞資源。我們揭示了回腸高度富集的CD160+ CD8+ T細(xì)胞的組織特異性特征，證明了其在MSI-H型CRC中的治療潛力——能夠增強(qiáng)抗PD-1療效并克服其耐藥性，提示其在泛癌治療中具有重要臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

Zheng T, Ding C, Lai S, Gao Y, Lyu C, Liu C, Shi J, Li X, Li M, Meng H, Li M, Liang Y, Tai S, Cheng L, Zhang Y, Li L, Han P, Sun B, Liu T, Geng F, Hao D, Zhang X. CD160 dictates anti-PD-1 immunotherapy resistance by regulating CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer. Nat Cell Biol. 2025 Sep 9. doi: 10.1038/s41556-025-01753-3. Epub ahead of print. PMID: 40925954.