Immunity：XBP1缺失破壞黏液屏障，協同壞死性凋亡惡化結腸炎

   內質網（ER）應激與壞死性凋亡（necroptosis）在炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)病機制中具有關聯性，但這些通路之間的潛在交互作用尚不明確。本研究顯示，在腸道上皮細胞（IEC）特異性缺失caspase-8或其銜接蛋白FADD（Fas associated with death domain）的小鼠中，X盒結合蛋白1（XBP1）的缺失會顯著加劇壞死性凋亡誘導的結腸炎（而非回腸炎）的發(fā)展。從機制上講，XBP1缺失導致結腸中黏蛋白2（MUC2）表達減少和黏液層形成受損，使得細菌能夠穿透并抵達上皮表面。在上皮單層結構完整的情況下，這并不足以引發(fā)結腸炎，但與IEC壞死性凋亡協同作用后會誘發(fā)嚴重結腸炎癥。我們的研究結果揭示，XBP1和caspase-8分別調控腸道屏障的不同組成部分，通過協同作用維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)并預防結腸炎癥。這一發(fā)現有助于更好地理解IBD的致病機制。本文于2025年8月發(fā)表于《Immunity》，IF 26.3。

圖形摘要

主要研究結果

1．XBP1抑制Casp8IEC-KO和FaddIEC-KO小鼠的壞死性凋亡誘導性結腸炎發(fā)展

   為研究XBP1和caspase-8在IECs中的作用，我們構建了Xbp1fl/fl × Vil1-Cre（Xbp1IEC-KO）和Casp8fl/fl × Vil1-Cre（Casp8IEC-KO）小鼠。與既往報道一致，Xbp1IEC-KO小鼠結腸未出現自發(fā)病理改變，而Casp8IEC-KO小鼠表現出輕度至重度結腸炎，特征包括增生、輕度上皮侵蝕、IEC死亡及免疫細胞浸潤（圖1A）。為評估XBP1與caspase-8在調節(jié)腸上皮穩(wěn)態(tài)中的潛在交互作用，我們構建并分析了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠（IECs中特異性缺失XBP1和caspase-8）。與Casp8IEC-KO及Xbp1fl/fl × Casp8fl/WT × Villin-cretg/WT（Xbp1IEC-KOCasp8IEC-Het）小鼠相比，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠體重顯著減輕（圖1B），表明IECs中XBP1與caspase-8的聯合缺失導致嚴重腸道病理改變。組織學分析顯示，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠出現嚴重結腸炎，表現為上皮過度增殖、IEC死亡數量增加、廣泛上皮侵蝕形成全結腸散布的潰瘍、黏膜及黏膜下層免疫細胞浸潤增加，以及大量隱窩膿腫形成（圖1A）。組織學結腸炎評分、潰瘍形成及上皮細胞增殖的量化分析證實，與Casp8IEC-KO小鼠相比，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠結腸病理惡化程度更高（圖1C–1E）。RNA測序（RNA-seq）顯示，與Xbp1IEC-KO和Casp8IEC-KO小鼠相比，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠結腸炎癥基因表達上調，進一步支持雙基因缺失比單基因缺失導致更嚴重的結腸炎癥（圖1F）。我們前期研究表明，通過RIPK3或MLKL基因缺失抑制壞死性凋亡可阻止Casp8IEC-KO小鼠結腸炎發(fā)展。因此我們探討：在XBP1介導的未折疊蛋白反應（UPR）與caspase-8信號聯合抑制后，壞死性凋亡是否參與加劇結腸炎。為此，我們構建并分析了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠。大體觀察、免疫組織學及RNA-seq分析表明，抑制RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡可完全恢復Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠體重并阻止結腸炎發(fā)展（圖1A和1C–1G）。IEC特異性缺失FADD的小鼠會發(fā)生自發(fā)性結腸炎，且嚴重程度高于Casp8IEC-KO小鼠。與Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的研究結果一致，并行免疫組織學評估與量化分析表明，Xbp1IEC-KOFaddIEC-KO小鼠比FaddIEC-KO小鼠發(fā)生更嚴重的結腸炎。RIPK3缺失同樣阻止了Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?小鼠結腸炎的發(fā)展。綜上所述，這些結果表明在上皮細胞中，XBP1通過抑制壞死性凋亡誘導的炎癥性結腸炎，在FaddIEC-KO和Casp8IEC-KO小鼠中發(fā)揮保護作用。

圖1 IEC特異性XBP1缺失加劇Casp8IEC-KO小鼠的壞死性凋亡誘導性結腸炎

2．XBP1缺失不會加劇Casp8IEC-KO和FaddIEC-KO小鼠的回腸炎

   Xbp1IEC-KO小鼠會發(fā)生自發(fā)性回腸炎，表現為上皮增生、潘氏細胞缺失和黏膜免疫細胞浸潤。此外，Casp8IEC-KO小鼠會發(fā)生依賴RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡的自發(fā)性回腸炎。為評估XBP1與caspase-8聯合缺失是否也會加劇回腸炎，我們比較了Xbp1IEC-KO、Casp8IEC-KO和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的回腸病理。對Xbp1IEC-KO小鼠回腸切片的溶菌酶免疫染色顯示隱窩中潘氏細胞數量減少，這與潘氏細胞特異性基因（包括溶菌酶Lyz1、Defa5和Defa-rs10）mRNA表達降低相關（圖2A和2B）。但我們在Xbp1IEC-KO小鼠回腸中未觀察到CD45免疫細胞浸潤顯著增加（這與既往研究報道不同），提示遺傳背景和/或微生物群的差異可能影響這些動物的小腸病理（圖2A）。與既往報道一致，Casp8IEC-KO小鼠出現自發(fā)性回腸炎，表現為潘氏細胞幾乎完全缺失、上皮增生、IEC死亡及免疫細胞浸潤增加（圖2A和2B）。Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠也發(fā)生自發(fā)性回腸炎，特征包括上皮增生、潘氏細胞缺失、IEC死亡及固有層免疫細胞浸潤（圖2A–2D）。并行組織病理學和基因表達分析表明，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的小腸病理與Casp8IEC-KO小鼠的回腸炎高度相似（圖2A–2D）。盡管Xbp1IEC-KO小鼠回腸組織學評分顯著升高（圖2C），但這主要歸因于該小鼠模型相關的隱窩增生（圖2D）。此外，Xbp1IEC-KOFaddIEC-KO小鼠的小腸病理也與FaddIEC-KO小鼠的回腸炎高度相似。這些結果表明，與結腸中XBP1缺失會加劇壞死性凋亡誘導的炎癥形成鮮明對比，IECs中XBP1缺失并未改變Casp8IEC-KO和FaddIEC-KO小鼠回腸炎的嚴重程度。

圖2 抑制caspase-8介導的凋亡和RIPK3-MLKL誘導的壞死性凋亡不能阻止XBP1缺失所致的潘氏細胞丟失

3．聯合抑制凋亡和壞死性凋亡不能阻止Xbp1IEC-KO小鼠的潘氏細胞丟失

   有觀點認為IEC凋亡參與Xbp1IEC-KO小鼠回腸的病理發(fā)展。為探究caspase-8介導的凋亡和RIPK3-MLKL誘導的壞死性凋亡是否導致Xbp1IEC-KO小鼠的上皮增生和潘氏細胞丟失，我們檢測了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?、Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?動物的小腸組織。免疫組織學與基因表達分析顯示，RIPK3或MLKL缺失將Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KO小鼠回腸炎嚴重程度降低至Xbp1IEC-KO小鼠水平（圖2A–2D）。但Ki67和溶菌酶免疫染色表明，聯合抑制caspase-8依賴性凋亡和RIPK3-MLKL依賴性壞死性凋亡并不能阻止XBP1缺失誘導的上皮增生和潘氏細胞丟失——Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?、Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?小鼠均表現出與Xbp1IEC-KO小鼠相似的小腸病理（圖2A–2D）。與溶菌酶免疫染色結果一致，定量RT-PCR（RT-qPCR）分析顯示Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠中Lyz1、Defa5和Defa-rs10表達顯著降低（圖2B）。我們推測不依賴caspase-8和壞死性凋亡的細胞死亡可能參與XBP1缺失誘導的潘氏細胞丟失和上皮增生。因此我們對Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?、Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?小鼠回腸切片進行cleaved caspase-3（CC3）和TUNEL染色。這些實驗未發(fā)現Xbp1IEC-KO、Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠隱窩內死亡IECs數量較對照組增加。與既往發(fā)現一致，我們檢測到Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?小鼠回腸中CC3和TUNEL陽性IECs數量較對照組增加。這些結果表明FADD-caspase-8依賴性凋亡和RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡不驅動Xbp1IEC-KO小鼠的潘氏細胞丟失和上皮增生。

4．上皮細胞固有的TNFR1信號驅動Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的結腸炎惡化

   IEC特異性腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）缺失可減輕Casp8IEC-KO小鼠的結腸炎發(fā)展。TNFR1也參與Xbp1IEC-KO小鼠回腸炎的發(fā)展。為探究IECs中TNFR1信號是否介導Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的嚴重結腸炎，我們構建并分析了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOTnfr1IEC-KO小鼠。免疫組織學評估和RNA-seq分析顯示，上皮TNFR1缺失強烈抑制了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOTnfr1IEC-KO小鼠的結腸炎發(fā)展（圖3A–3E）。有觀點認為，XBP1缺失的IECs和/或潘氏細胞中核因子κB（NF-κB）激活可能驅動腫瘤壞死因子（TNF）產生，從而參與Xbp1IEC-KO小鼠的腸炎發(fā)生。因此我們推測IEC來源的TNF水平升高可能加劇Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的結腸炎。為驗證該假設，我們構建并分析了IECs中特異性缺失XBP1、caspase-8和TNF的Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOTnfIEC-KO小鼠。結腸切片免疫組織學分析表明，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOTnfIEC-KO小鼠發(fā)生的結腸炎嚴重程度與Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠相似（圖3A–3D），排除了IEC來源的TNF在驅動該病理中的作用。此外，IEC特異性缺失TNF或TNFR1并未緩解Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的潘氏細胞丟失和小腸病理。這些結果與我們之前的發(fā)現一致：TNFR1在Casp8IEC-KO小鼠壞死性凋亡驅動的小腸炎癥中不起重要作用。綜上結果表明，上皮細胞固有的TNFR1信號驅動Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的結腸炎惡化，但IEC來源的TNF并不起重要作用。

圖3 IECs中TNFR1信號加重Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的結腸炎嚴重程度

5．IEC特異性XBP1缺失損害結腸黏液層形成

   RNA-seq數據分析顯示，Xbp1IEC-KO小鼠結腸中僅有的顯著減少的轉錄本是Muc2（圖4A）。RT-qPCR分析、免疫染色及特異性抗體免疫印跡均證實，與對照組相比，Xbp1IEC-KO小鼠結腸中MUC2 mRNA和蛋白表達降低（圖4B）。Xbp1IEC-KO小鼠結腸杯狀細胞數量未減少，但細胞體積較小且MUC2表達降低。MUC2是腸道中最豐富的凝膠形成型黏蛋白，也是黏液層的主要組成部分。阿爾新藍- PAS（AB-PAS）染色顯示，與同窩對照組相比，Xbp1IEC-KO小鼠結腸黏蛋白水平降低。RNA-seq數據分析表明，其他黏液相關基因在Xbp1IEC-KO小鼠結腸中未見顯著改變。MUC2是結腸上皮表面不可穿透黏液層的關鍵組分，能阻止管腔細菌與腸上皮細胞接觸。我們推測IEC特異性XBP1缺失導致的Muc2表達減少可能損害黏液層形成，使得更多細菌接觸上皮，從而加劇Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KO小鼠的結腸炎發(fā)展。為研究MUC2產生減少是否會破壞Xbp1IEC-KO小鼠保護性黏液層的形成，我們檢測了用卡諾固定液（可保留黏液結構）固定的含糞便物質遠端結腸組織切片。AB-PAS染色及MUC2免疫染色顯示對照組小鼠結腸存在完整厚黏液層（圖4C）。與之形成鮮明對比的是，Xbp1IEC-KO小鼠結腸黏液層厚度顯著減少，部分區(qū)域完全缺失黏液層（圖4C）。為量化比較黏液層厚度，我們測量了黏液總面積并將其與各小鼠結腸上皮周緣長度標準化。分析表明IEC特異性XBP1缺失導致整體黏液層厚度顯著減少（圖4D）。為評估Xbp1IEC-KO小鼠結腸中細菌與上皮表面的分離是否受損，我們采用真細菌核糖體RNA特異性探針（EUB338）進行熒光原位雜交（FISH），隨后利用荊豆凝集素I（UEA-I）對α-連接巖藻糖殘基進行免疫熒光染色以顯示黏液層。對照組小鼠中細菌與結腸上皮明顯分離，而Xbp1IEC-KO小鼠結腸中細菌侵入受損黏液層并與腸上皮細胞表面接觸（圖4E）。這些結果表明，IEC特異性XBP1缺失導致MUC2表達減少并損害保護性黏液層形成，使管腔細菌得以接觸結腸上皮。

圖4 IECs中XBP1表達調控結腸MUC2表達及黏液層形成

6．Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠出現細菌易位至結腸黏膜和全身性炎癥

   我們推測XBP1缺失引起的黏液層形成受損， combined with caspase-8缺失IECs壞死性凋亡所致上皮屏障破壞，可使細菌侵入黏膜和黏膜下層，導致Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠發(fā)生嚴重結腸炎。首先我們證實Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠也表現出MUC2表達降低和總黏蛋白水平減少（圖5A）。與既往報道稱IEC特異性caspase-8缺失降低結腸MUC2表達相反，我們的RNA-seq、RT-qPCR分析、MUC2免疫染色及AB-PAS染色均未發(fā)現Casp8IEC-KO小鼠結腸MUC2表達或黏液水平較對照組降低（圖5A）。因此Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠結腸黏蛋白水平降低源于XBP1而非caspase-8缺失。為評估細菌向上皮下層易位情況，我們采用FISH技術對Casp8IEC-KO和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠瑞士卷結腸切片進行細菌16s rRNA染色。果然，在幾乎所有Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠（11只中10只）的黏膜下層檢測到細菌存在，而Casp8IEC-KO小鼠僅37.5%（24只中9只）出現此現象（圖5B）。此外，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠（而非Casp8IEC-KO小鼠）出現脾臟腫大和外周血粒細胞、單核細胞數量增加（圖5C和5D），表明細菌向上皮下層易位引發(fā)了全身免疫激活。這些結果證明，IEC特異性XBP1與caspase-8聯合缺失導致細菌從管腔易位至結腸上皮下層并引發(fā)全身性炎癥。

圖5 上皮特異性XBP1抑制細菌易位并阻止Casp8IEC-KO小鼠全身性炎癥

7．抑制壞死性凋亡可阻止Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的細菌易位和全身性炎癥

   MUC2僅由結腸上皮杯狀細胞產生和分泌。我們探究XBP1缺失是否可能誘導杯狀細胞死亡，從而間接導致MUC2表達減少和黏液層受損。為此我們通過CC3免疫染色和TUNEL染色評估Xbp1IEC-KO與對照組小鼠結腸細胞死亡情況。未檢測到Xbp1IEC-KO小鼠結腸死亡細胞數量增加，不支持XBP1缺失導致杯狀細胞死亡的假設。我們隨后檢驗聯合抑制caspase-8誘導的凋亡和RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡能否挽救IEC特異性XBP1缺失導致的MUC2表達受損和黏液層形成障礙。我們對Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠結腸切片進行MUC2免疫染色與AB-PAS染色，并對IECs中MUC2表達進行免疫印跡分析。這些實驗表明聯合抑制凋亡和壞死性凋亡未能挽救Xbp1IEC-KO小鼠的MUC2表達減少。此外，結腸橫截面黏液層可視化與量化顯示，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠的黏液層形成缺陷與Xbp1IEC-KO小鼠相似（圖6A和6B）。這些結果表明Xbp1IEC-KO小鼠黏蛋白水平降低和黏液層形成受損并非由杯狀細胞壞死性凋亡和/或凋亡增加引起。

圖6 上皮特異性XBP1以不依賴內在凋亡和壞死性凋亡的方式調控Muc2表達

   我們隨后評估抑制壞死性凋亡能否阻止細菌侵入Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠黏膜和黏膜下層。與MUC2表達減少一致，我們發(fā)現細菌可侵入受損黏液層并抵達Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠結腸上皮表面（圖6A）。但結腸瑞士卷切片16s rRNA FISH染色顯示，細菌未浸潤Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠結腸黏膜下層（圖6C）。與無細菌浸潤一致，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠未出現全身性炎癥跡象，表現為脾臟大小正常且外周血粒細胞、單核細胞數量與同窩對照組相當（圖6D）。這些結果表明，抑制壞死性凋亡雖不能挽救黏液層缺陷，但通過修復上皮屏障阻止了細菌向上皮下層浸潤。

8．XBP1缺失以杯狀細胞內在方式減少Muc2表達

   腸道微生物群的存在與組成調節(jié)結腸MUC2產生及黏液層通透性和厚度。因此我們探究XBP1缺失是以細胞內在方式還是通過影響微生物群等其他因素間接導致Muc2表達減少。為解答此問題，我們培養(yǎng)對照組和Xbp1IEC-KO小鼠結腸類器官，并通過γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號誘導其分化為杯狀細胞（圖7A）。RT-qPCR分析顯示DAPT處理強烈誘導對照組結腸類器官Muc2表達，而Xbp1IEC-KO小鼠類器官中Muc2表達顯著降低（圖7B）。XBP1缺失不影響杯狀細胞分化，表現為對照組與XBP1缺失類器官中分泌細胞命運決定關鍵轉錄因子（包括Atoh1（Math1）、Spdef和Klf4）表達水平相當（圖7B）。這些發(fā)現與Xbp1IEC-KO小鼠結腸杯狀細胞數量未改變一致，且RNA-seq分析顯示Xbp1IEC-KO小鼠結腸杯狀細胞分化基因未減少（圖4A）。因此XBP1缺失以細胞內在方式抑制杯狀細胞MUC2表達。

圖7 XBP1以杯狀細胞內在方式調控Muc2表達

   IEC特異性XBP1缺失導致需肌醇酶1α（IRE1α）激活，表現為與對照組相比Xbp1IEC-KO小鼠結腸IECs中IRE1α磷酸化增加，這與既往報道一致。IRE1α自磷酸化誘導其核糖核酸酶結構域介導的RNase活性，從而介導未剪接Xbp1（Xbp1u）的非經典剪接，產生剪接型Xbp1（Xbp1s）。除Xbp1u的非經典剪接外，IRE1α還能通過其核酸內切酶結構域降解特定mRNA池，該過程稱為 regulated IRE1-dependent decay（RIDD）。因此我們推測Muc2可能是XBP1缺失杯狀細胞中活性IRE1α通過RIDD降解的靶標。為驗證該假設，我們用IRE1α高特異性激酶抑制劑G′9668處理對照組或Xbp1IEC-KO小鼠類器官（圖7C）。Cre介導的Xbp1基因loxP側翼外顯子2切除導致移碼突變并引入提前終止密碼子，使XBP1S蛋白表達缺失。由于外顯子2缺失后IRE1介導的剪接位點保留且XBP1S缺失誘導IRE1激活，我們可通過Xbp1剪接實驗評估對照組或Xbp1IEC-KO小鼠類器官中IRE1活性（圖7D）。RT-PCR檢測Xbp1u和Xbp1s顯示XBP1缺失類器官中Xbp1剪接增加，而IRE1激酶抑制劑G′9668可抑制此現象（圖7D）。但RT-qPCR分析表明缺失XBP1的杯狀細胞分化類器官中Muc2 mRNA表達在G′9668處理后未增加（圖7E）。除IRE1α外，黏膜上皮細胞表達IRE1旁系同源蛋白IRE1β（基因名ERN2）。IRE1β在杯狀細胞中高度富集，對維持黏膜穩(wěn)態(tài)起重要作用。與IRE1α相似，IRE1β含核酸內切酶結構域，可執(zhí)行Xbp1u的非經典剪接。有觀點認為IRE1β的核酸內切酶活性可降解Muc2 mRNA并參與腸道黏蛋白穩(wěn)態(tài)。在Xbp1剪接實驗中，我們檢測到IRE1α激酶抑制劑G′9668存在時仍有殘留Xbp1s條帶（圖7D）。因此我們探究XBP1缺失的杯狀細胞中IRE1β是否可能被激活并降解Muc2 mRNA。為此我們用IRE1核酸內切酶抑制劑4μ8C（可抑制IRE1α和IRE1β的核酸內切酶活性）處理杯狀細胞分化的對照組或Xbp1?/?類器官。確實，4μ8C處理抑制了IRE1激活（通過XBP1缺失類器官中Xbp1剪接檢測證實）（圖7D）。此外，4μ8C處理使Xbp1?/?類器官Muc2 mRNA表達恢復至對照組水平（圖7E）。IRE1抑制不改變DAPT誘導的結腸類器官杯狀細胞分化。這些結果支持Muc2在缺失XBP1的杯狀細胞中被IRE1β降解。

   前梯度蛋白同源物2（AGR2）屬于蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）家族，與炎癥性腸?。↖BD）存在關聯。Agr2?/?小鼠表現為上皮內質網應激、隨年齡進展的直腸脫垂，以及右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的急性重癥結腸炎易感性。AGR2在杯狀細胞中高度富集表達，其缺失會導致杯狀細胞MUC2產生減少和結腸黏液層形成受損，表明AGR2在維持腸道上皮內質網穩(wěn)態(tài)和MUC2生物合成中起關鍵作用。此外，研究提出XBP1可調控肺上皮細胞中Agr2表達。AGR2與IRE1β相互作用，阻止其激活以及IRE1β介導的Xbp1u剪接。因此我們推測XBP1缺陷的杯狀細胞可能表現出AGR2表達受損，導致IRE1β激活進而引起Muc2 mRNA降解。確實，免疫印跡分析顯示與對照組相比，Xbp1IEC-KO小鼠IECs中AGR2表達減少（圖7F）。與此一致，缺失XBP1的杯狀細胞分化類器官中Agr2 mRNA表達較對照組降低（圖7G）。雖然G′9668和4μ8C處理未改變Xbp1?/?類器官中Agr2表達，但抑制IRE1α激酶活性或IRE1α/IRE1β核酸內切酶活性會降低對照組類器官的Agr2表達（圖7G），表明剪接型XBP1可誘導Agr2表達。與各自對照組相比，XBP1缺陷的IECs或Xbp1?/?類器官中IRE1β表達未受影響。為研究XBP1是否調控AGR2表達，我們采用衣霉素孵育類器官化學誘導內質網應激（圖7H）。Xbp1u剪接增加以及Hspa5（免疫球蛋白結合蛋白[BiP]）mRNA表達升高證實衣霉素處理成功誘導類器官內質網應激（圖7I和7J）。此外，RT-qPCR分析顯示對照組和XBP1缺陷類器官中Pdia6（激活轉錄因子6[ATF6]介導的UPR靶基因）被強烈誘導（圖7J）。但缺失XBP1的類器官未能上調兩個已知XBP1靶基因Dnajb9和Sec61a1的表達（圖7J）。而且與對照組類器官相反，衣霉素處理未能增加Xbp1?/?類器官中Agr2表達（圖7J）。這些結果表明XBP1通過誘導AGR2表達阻止IRE1β激活并抑制IRE1β介導的Muc2 mRNA降解。

結論

   我們的研究揭示了IECs中內質網應激與壞死性凋亡調控之間存在重要交互作用，共同維持健康的免疫穩(wěn)態(tài)并預防腸道炎癥。這些發(fā)現暗示不同通路間的功能冗余可能是大多數IBD易感基因外顯率低的基礎，并表明可能需同時影響腸道屏障不同組分的聯合缺陷才能啟動腸道炎癥并使其慢性化。

參考文獻：

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