重磅發(fā)現(xiàn)：m5C修飾的circRREB1通過(guò)誘導(dǎo)線粒體自噬促進(jìn)肺癌進(jìn)展！

   肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的首要原因。環(huán)狀RNA（circRNAs）具有重要的生物學(xué)功能，并與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾能夠調(diào)控RNA 分子的分子命運(yùn)，從而影響疾病的發(fā)展。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RREB1 在肺癌組織和細(xì)胞中高度表達(dá)，而高表達(dá)環(huán)狀RREB1 的患者預(yù)后較差。我們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀 RREB1 通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2 的介導(dǎo)進(jìn)行 m5C 修飾。這種修飾通過(guò)m5C 讀取器 ALYREF 促進(jìn)其向細(xì)胞核的輸出。功能研究表明，環(huán)狀RREB1 在體外和體內(nèi)均促進(jìn)肺癌的發(fā)展。從機(jī)制上講，環(huán)狀RREB1 直接與 HSPA8 結(jié)合，并通過(guò)抑制依賴于泛素的降解來(lái)穩(wěn)定它，從而通過(guò)HSPA8/PINK1/Parkin 信號(hào)軸誘導(dǎo)線粒體自噬，并最終促進(jìn)肺癌的發(fā)展。該研究于2025年7月發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：12.8。

技術(shù)路線

Graphical Abstract

主要研究結(jié)果：

1.circRREB1在肺癌中顯著上調(diào)

   我們以人類(lèi)支氣管黏膜上皮細(xì)胞作為對(duì)照組，以砷誘導(dǎo)的惡性細(xì)胞模型作為實(shí)驗(yàn)組，構(gòu)建了差異性的環(huán)狀 RNA 表達(dá)圖譜，以確定在肺癌中起關(guān)鍵作用的環(huán)狀 RNA（圖 1A）。通過(guò)對(duì)高表達(dá)的環(huán)狀RNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及KEGG通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與癌癥密切相關(guān)的環(huán)狀RNA，即circRREB1（圖 1B）。隨后，我們檢測(cè)了circRREB1 在BEAS-2B、A549、H1299、HCC827和H460細(xì)胞中的表達(dá)情況，qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circRREB1 在這些肺癌細(xì)胞系中高度表達(dá)（圖 1C）。此外，我們還評(píng)估了circRREB1在60對(duì)肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明肺癌組織中的 circRREB1 表達(dá)顯著上調(diào)（圖 1D）。同時(shí)，深入的臨床相關(guān)性分析顯示，circRREB1 的表達(dá)與腫瘤分級(jí)和腫瘤直徑呈正相關(guān)（圖 1E、F）；ROC 分析顯示曲線下面積（AUC）為 0.859（圖 1G）。基于這些結(jié)果，我們認(rèn)為circRREB1 有可能成為肺癌的診斷標(biāo)志物。隨后的生存分析顯示，circRREB1 高表達(dá)的患者預(yù)后比低表達(dá)的患者更差（圖 1H）。

   我們?cè)L問(wèn)了 UCSC 基因?yàn)g覽器網(wǎng)站，以全面描述circRREB1 的特征，并發(fā)現(xiàn)circRREB1由位于6號(hào)染色體上的 RREB1 基因的第2至6個(gè)外顯子通過(guò)反向剪接形成，其環(huán)化位點(diǎn)通過(guò)Sanger測(cè)序得到了確認(rèn)（圖 1I）。與線性 RNA 相比，circRNA 對(duì)線性核酸酶的消化具有抵抗力。在用 RNase R 處理總 RNA 樣本后，circRREB1 比線性 GAPDH 更耐受 RNase R 的消化（圖 1J）。我們還設(shè)計(jì)了 circRREB1 特定的正向和反向引物，并使用三組樣本（RNase R - 組、RNase R + 組和 gDNA 組）進(jìn)行了 PCR 擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和成像，由正向引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物比由反向引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物更耐受 RNase R 的消化（圖 1K）。隨后，我們用 Act D 處理細(xì)胞，提取 0 小時(shí)、4 小時(shí)、8 小時(shí)、12 小時(shí)和 24 小時(shí)的 RNA，并通過(guò) qPCR 檢測(cè) circRREB1 和 RREB1 的表達(dá)。結(jié)果表明，circRREB1 的半衰期比 RREB1 更長(zhǎng)（圖 1L）。通過(guò)上述結(jié)果，我們確定 circRREB1 具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。最后，通過(guò)在肺細(xì)胞系 A549 和 H1299 上進(jìn)行的熒光原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)，以及在 A549 細(xì)胞中進(jìn)行的核-質(zhì)分離分析，我們研究了 circRREB1 的亞細(xì)胞定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circRREB1 主要位于細(xì)胞質(zhì)中。（圖 1M、N）。然而，我們使用 BEAS-2B 細(xì)胞進(jìn)行的 FISH 實(shí)驗(yàn)顯示，circRREB1 主要位于細(xì)胞核中（補(bǔ)充圖 S1A）。

圖1. circRREB1在肺癌中顯著上調(diào)

2.circRREB1的m5C修飾

   我們的初步研究發(fā)現(xiàn)，circRREB1在A549 和 BEAS-2B 細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位存在差異。鑒于異常的環(huán)狀 RNA 表達(dá)通常與腫瘤發(fā)展有關(guān)，我們旨在詳細(xì)探究環(huán)狀 RNA 表達(dá)差異的原因。m5C修飾在調(diào)節(jié)環(huán)狀RNA的命運(yùn)中起著關(guān)鍵作用。我們使用癌組織作為實(shí)驗(yàn)組，相鄰的非癌組織作為對(duì)照組，進(jìn)行了 m5C 微陣列芯片檢測(cè)，以獲得環(huán)狀 RNA 的差異 m5C 修飾圖譜。結(jié)果表明，circRREB1 可能被 m5C 修飾（圖 2A）。我們使用 m5C 修飾特異性抗體進(jìn)行了 MeRIP 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) m5C 抗體顯著富集了 circRREB1，這表明 circRREB1 中存在 m5C 修飾（圖 2B、C）。隨后，我們?cè)?50 個(gè)堿基對(duì)的片段中設(shè)計(jì)了特異性的截短引物，并進(jìn)行了 CLIP 實(shí)驗(yàn)，以探索環(huán)狀 RNA 上 m5C 修飾的位置。qPCR 結(jié)果顯示，m5C 修飾位于第二個(gè)片段（圖 2D）。

   m5C 修飾需要甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）的參與。此前的研究表明，真核生物的 m5C 修飾通常由 NOL1/NOP2/sun（NSUN）家族和 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶成員 2（DNMT2）介導(dǎo)。我們最初進(jìn)行了 TRAP 實(shí)驗(yàn)，以確定介導(dǎo) circRREB1 的 m5C 修飾的writers。經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和銀染處理后，我們進(jìn)行了液相色譜 - 質(zhì)譜分析（LC-MS）以確定與 circRREB1 結(jié)合的蛋白質(zhì)（圖 2E）。根據(jù) LC-MS 結(jié)果，我們確定了 NSUN2，這是一種已被報(bào)道介導(dǎo) m5C 修飾的寫(xiě)入者。通過(guò)查詢 The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn) NSUN2 在肺癌組織中高度表達(dá)，且高表達(dá) NSUN2 的患者比低表達(dá) NSUN2 的患者預(yù)后更差（補(bǔ)充圖 S1B、C）。這一趨勢(shì)與肺癌組織中 circRREB1 高表達(dá)的趨勢(shì)一致。因此，我們選擇了 NSUN2 進(jìn)行進(jìn)一步研究。在 NSUN2 過(guò)表達(dá)后，我們進(jìn)行了 MeRIP 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，circRREB1 的 m5C 修飾水平顯著升高（圖 2F、G）。

   m5C 修飾的生物學(xué)功能通常與識(shí)別蛋白有關(guān)。我們的 TRAP-MS 結(jié)果顯示，在本研究中，主要的 m5C 識(shí)別蛋白是 Aly/REF 輸出因子（ALYREF），它已被證實(shí)能夠識(shí)別 m5C 修飾并調(diào)節(jié) RNA 穩(wěn)定性和核輸出。來(lái)自 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)表明，ALYREF 在肺癌患者中高度表達(dá)，且高 ALYREF 表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)（圖 2H，補(bǔ)充圖 S1D）。這一趨勢(shì)與肺癌組織中 circRREB1 的高表達(dá)及其主要位于細(xì)胞質(zhì)相一致。因此，ALYREF 被選作進(jìn)一步研究的對(duì)象。我們首先進(jìn)行了 RIP 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) circRREB1 直接與 ALYREF 結(jié)合（圖 2I）。隨后的 CLIP-qPCR 顯示，circRREB1 與 ALYREF 的結(jié)合區(qū)域位于第二段，這與 m5C 修飾段一致（圖 2J）。在 NSUN2 過(guò)表達(dá)的情況下，ALYREF 能夠富集更多的 circRREB1（圖 2K）。這些結(jié)果表明，ALYREF 能夠識(shí)別 circRREB1 上的 m5C 修飾。我們?cè)O(shè)計(jì)了 ALYREF siRNA 來(lái)探究 ALYREF 報(bào)道的調(diào)節(jié) RNA 分子命運(yùn)的途徑（圖 2L）。通過(guò)進(jìn)行 RNA 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn) ALYREF 基因沉默后，circRREB1 的穩(wěn)定性并未發(fā)生變化（補(bǔ)充圖 S1E）。熒光原位雜交（FISH）和核-質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)表明，ALYREF 基因沉默后，circRREB1 的核含量顯著增加（圖 2M、N）。這一發(fā)現(xiàn)表明，沉默 ALYREF 可增加 circRREB1 的核表達(dá)，這與肺癌組織中ALYREF 的高表達(dá)相一致。我們還發(fā)現(xiàn)，NSUN2 過(guò)表達(dá)顯著增加了 circRREB1 的核輸出，而 ALYREF 基因沉默則逆轉(zhuǎn)了由 NSUN2 過(guò)表達(dá)引起的核輸出增加（圖 2O）。綜上所述，這些結(jié)果表明，NSUN2 增加了 circRREB1 的 m5C 修飾水平，而 ALYREF 能夠識(shí)別 circRREB1 的 m5C 修飾，并以 m5C 依賴的方式調(diào)節(jié) circRREB1 的核輸出。

圖2. circRREB1的m5C修飾

3.circRREB1在體外顯著促進(jìn)肺癌進(jìn)展

   我們構(gòu)建了 circRREB1 基因沉默和過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，以探究 circRREB1 的生物學(xué)功能（見(jiàn)補(bǔ)充圖 S2A）。EdU 檢測(cè)顯示，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞增殖減少，而過(guò)表達(dá)后細(xì)胞增殖增加（圖 3A、B）。CCK-8 檢測(cè)顯示，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞活力降低，而過(guò)表達(dá)后細(xì)胞活力增加（圖 3C）。細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)分析表明，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞周期進(jìn)程受到抑制，而過(guò)表達(dá)后細(xì)胞周期進(jìn)程加快（圖 3D、E）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞凋亡增加，而過(guò)表達(dá)后細(xì)胞凋亡減少（圖 3F、G）。Transwell 和傷口愈合檢測(cè)顯示，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞遷移減少，而過(guò)表達(dá)后細(xì)胞遷移增加（圖 3H、I；補(bǔ)充圖 S2B、C）。總之，circRREB1 在體外能夠顯著促進(jìn)肺癌的發(fā)展。為進(jìn)一步闡明 m5C 修飾對(duì) circRREB1 生物學(xué)功能的影響，我們同時(shí)抑制了閱讀蛋白 ALYREF 的表達(dá)，并過(guò)表達(dá)了 circRREB1，隨后評(píng)估了細(xì)胞活力和遷移能力。circRREB1 的過(guò)表達(dá)恢復(fù)了由 ALYREF 抑制所導(dǎo)致的細(xì)胞活力和遷移能力的下降（補(bǔ)充圖 S2D-F）。

圖3. circRREB1在體外顯著促進(jìn)肺癌進(jìn)展

4.circRREB1在體內(nèi)顯著促進(jìn)肺癌進(jìn)展

   我們闡明了環(huán)狀 RNA RREB1 在肺癌中的體外作用機(jī)制，隨后又探究了其在體內(nèi)的作用。首先，我們成功構(gòu)建了一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)狀 RNA RREB1 編輯沉默的 A549 細(xì)胞系（補(bǔ)充圖 S2G、H）。對(duì)照細(xì)胞和穩(wěn)定的環(huán)狀 RNA RREB1 編輯沉默細(xì)胞被皮下注射到裸鼠的右側(cè)腹側(cè)。在腫瘤形成后，每隔三天觀察一次裸鼠的存活狀況，并對(duì)每只裸鼠的體重和腫瘤體積進(jìn)行評(píng)估和記錄。在觀察期結(jié)束時(shí)，對(duì)裸鼠進(jìn)行Euthanasia，并收集腫瘤組織進(jìn)行拍照（圖 4A、B）。對(duì)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示在環(huán)狀 RNA RREB1 編輯沉默后，腫瘤生長(zhǎng)速度變慢（圖 4C）。我們進(jìn)行了免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步闡明環(huán)狀 RNA RREB1 在體內(nèi)的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定環(huán)狀 RNA RREB1 編輯沉默的腫瘤組織中，與增殖相關(guān)的蛋白 Ki67、與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白 cyclin D1、與凋亡相關(guān)的蛋白 BCL2 以及與遷移相關(guān)的蛋白 RhoA 的表達(dá)水平均降低（圖 4D-G）。補(bǔ)充圖 S2I-L）。總之，這些結(jié)果表明，circRREB1 在體內(nèi)能夠顯著促進(jìn)肺癌的發(fā)展。

圖4. circRREB1在體內(nèi)顯著促進(jìn)肺癌進(jìn)展

5.circRREB1通過(guò)線粒體自噬調(diào)節(jié)線粒體功能

   通過(guò)體外和體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)circRREB1能夠促進(jìn)肺癌的發(fā)展。然而，circRREB1促進(jìn)肺癌發(fā)展的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。我們對(duì)TRAP-MS的結(jié)果進(jìn)行了KEGG通路富集分析，并確定了幾個(gè)與細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)相關(guān)的通路（圖5A）。研究表明，通過(guò)細(xì)胞色素P450酶代謝各種藥物或化學(xué)毒素所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致線粒體功能障礙。因此，我們?cè)u(píng)估了線粒體功能。通過(guò)JC-1染色，我們檢測(cè)到在circRREB1沉默后，JC-1聚集體的水平（以紅色熒光表示）降低，而JC-1單體的水平（以綠色熒光表示）升高，這表明線粒體膜電位降低。相比之下，circRREB1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致JC-1聚集體水平升高，JC-1單體水平降低，表明線粒體膜電位升高（圖5B）。此外，在進(jìn)行 TMRE 染色后還進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，以檢測(cè)線粒體膜電位。這些結(jié)果與 JC-1 染色的結(jié)果一致，JC-1 染色顯示，沉默 circRREB1 會(huì)降低線粒體膜電位，而過(guò)表達(dá) circRREB1 則會(huì)增加線粒體膜電位（圖 5C、D）。我們還測(cè)量了細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平，發(fā)現(xiàn)沉默 circRREB1 后 ROS 水平升高，而過(guò)表達(dá) circRREB1 后 ROS 水平降低，這表明在沉默 circRREB1 后線粒體功能受損，在過(guò)表達(dá) circRREB1 后線粒體功能增強(qiáng)（圖 5E、F）。

   線粒體自噬是通過(guò)特定方式專門(mén)針對(duì)受損線粒體進(jìn)行的自噬過(guò)程，是調(diào)節(jié)線粒體功能的關(guān)鍵途徑。我們使用 MitoTracker Green 和 LysoTracker Red 分別對(duì)線粒體和溶酶體進(jìn)行標(biāo)記，并觀察線粒體與溶酶體的共定位情況，以探究 circRREB1 是否能調(diào)節(jié)線粒體自噬。我們發(fā)現(xiàn)，沉默 circRREB1 顯著降低了線粒體與溶酶體的共定位，而過(guò)表達(dá) circRREB1 則顯著增加了這種共定位，這表明 circRREB1 能夠正向調(diào)節(jié)線粒體自噬（圖 5G、H）。PINK1/Parkin 途徑是線粒體自噬的經(jīng)典途徑。我們進(jìn)行了 WB 檢測(cè)與 PINK1 介導(dǎo)的線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，沉默 circRREB1 降低了 PINK1、Parkin 和 LC3 的表達(dá)，并增加了線粒體外膜蛋白 TOM20 的表達(dá)。相比之下，過(guò)表達(dá) circRREB1 增加了 PINK1、Parkin 和 LC3 的表達(dá)，并降低了 TOM20 的表達(dá)，這表明 circRREB1 能夠在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)線粒體自噬（圖 5I、補(bǔ)充圖 S3A-D）。我們通過(guò)在異種移植組織上進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以評(píng)估 PINK1 和 Parkin 的水平，來(lái)探究 circRREB1 是否在體內(nèi)促進(jìn)線粒體自噬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制 circRREB1 的表達(dá)會(huì)降低其水平（圖 5J-L）。隨后，我們從裸鼠的腫瘤組織中提取蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)與線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)。與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致的是，穩(wěn)定抑制 circRREB1 顯著降低與線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)（補(bǔ)充圖 S3E）。當(dāng)同時(shí)抑制 m5C 讀取器 ALYREF 并過(guò)表達(dá) circRREB1 時(shí)，線粒體與溶酶體的共定位顯示，m5C 修飾也調(diào)節(jié)了由 circRREB1 過(guò)表達(dá)引起的共定位增加（補(bǔ)充圖 S3F、G）。當(dāng)過(guò)表達(dá) circRREB1 后，用自噬抑制劑氯喹（CQ）處理細(xì)胞，并檢測(cè)活性氧（ROS）水平時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)氯喹的加入抑制了自噬，導(dǎo)致 ROS 水平升高，表明受損線粒體的數(shù)量增加了（圖 5M、N）。這些結(jié)果表明，circRREB1 通過(guò)線粒體自噬增強(qiáng)線粒體功能。我們添加了氯喹以抑制線粒體自噬，并檢測(cè)了細(xì)胞凋亡的水平，以探究環(huán)狀 RREB1 是否通過(guò)線粒體自噬來(lái)調(diào)控肺癌的發(fā)展，并發(fā)現(xiàn)添加氯喹能夠逆轉(zhuǎn)由環(huán)狀 RREB1 過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡減少現(xiàn)象（補(bǔ)充圖 S3H、I）?？傊h(huán)狀RREB1 可能通過(guò) PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬來(lái)調(diào)節(jié)線粒體功能，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)展。

圖5.circRREB1通過(guò)線粒體自噬調(diào)節(jié)線粒體功能

6.circRREB1與HSPA8蛋白結(jié)合，抑制其泛素化和降解

   circRREB1 能夠調(diào)節(jié) PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬過(guò)程，然而針對(duì) circRREB1 的 TRAP-MS 結(jié)果并未包含 PINK1 蛋白，且沉默和過(guò)表達(dá) circRREB1 并未顯著改變 PINK1 的 mRNA 水平（補(bǔ)充圖 S4A）。我們推測(cè)，circRREB1 可能通過(guò)中間蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 PINK1 的表達(dá)。因此，我們將與通過(guò) TRAP-MS 識(shí)別的蛋白質(zhì)相關(guān)的自噬相關(guān)基因進(jìn)行交叉分析，創(chuàng)建了一個(gè)維恩圖，并選擇了 HSPA8 蛋白（圖 6A）。在沉默和過(guò)表達(dá) circRREB1 后，HSPA8 mRNA 的水平未發(fā)生變化（補(bǔ)充圖 S4B）。因此，我們推測(cè) circRREB1 可能直接與 HSPA8 蛋白相互作用，從而影響其表達(dá)。我們進(jìn)行了 FISH 和 IF 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) circRREB1 和 HSPA8 共定位（圖 6B）。與 IgG 相比，在 RIP 實(shí)驗(yàn)中，HSPA8 對(duì) circRREB1 的結(jié)合更多（圖 6C、D）。這些結(jié)果表明 circRREB1 直接與 HSPA8 結(jié)合。為確定 circRREB1 和 HSPA8 之間的結(jié)合區(qū)域，我們進(jìn)行了 CLIP 實(shí)驗(yàn)。通過(guò) CLIP 實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn) HSPA8 與 circRREB1 的第 13 區(qū)域結(jié)合（圖 6E）。隨后，我們利用 RBPMap預(yù)測(cè)了環(huán)狀 RREB1 第 13 節(jié)段中的潛在蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)了針對(duì)這些結(jié)合區(qū)域的節(jié)段特異性引物以及相應(yīng)的突變引物。CLIP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了環(huán)狀 RREB1 與 HSPA8 之間存在特定的結(jié)合模式（圖 6F、G）。

   隨后，我們進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)以檢測(cè) HSPA8 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) circRREB1 能夠正向調(diào)節(jié) HSPA8 蛋白的表達(dá)（圖 6H，補(bǔ)充圖 S4C）。對(duì)來(lái)自裸鼠腫瘤組織提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在穩(wěn)定沉默 circRREB1 的組中，HSPA8 的表達(dá)有所降低（圖 6I）。通過(guò)免疫組織化學(xué)法，我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定沉默 circRREB1 后，其表達(dá)水平顯著降低（圖 6J，補(bǔ)充圖 S4D）。通過(guò)查詢 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)肺癌患者中 HSPA8 的表達(dá)增加，且 HSPA8 高表達(dá)組的生存率低于低表達(dá)組，這與 circRREB1 作為致癌因子的作用一致（補(bǔ)充圖 S4E，F(xiàn)）。由于 ALYREF 可以作為 circRREB1 的 m5C 修飾的讀取蛋白來(lái)調(diào)節(jié) circRREB1 的核輸出，因此我們過(guò)表達(dá) circRREB1 并同時(shí)沉默 ALYREF。在 ALYREF 被沉默后，circRREB1 的核輸出減少，HSPA8 的表達(dá)也降低，這通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)；值得注意的是，這些變化在 circRREB1 過(guò)表達(dá)的情況下又恢復(fù)了原狀（圖 6K、L）。

   許多研究表明，circRNAs 可通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)。首先，我們用 CHX 抑制蛋白質(zhì)合成。與對(duì)照組相比，circRREB1 缺失組的 HSPA8 蛋白穩(wěn)定性較差，半衰期更短（圖 6M、補(bǔ)充圖 S4G）。當(dāng)我們添加蛋白酶體抑制劑 MG132 時(shí)，我們發(fā)現(xiàn) circRREB1 無(wú)法調(diào)節(jié) HSPA8 的表達(dá)（圖 6N）。我們進(jìn)行了共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步研究 circRREB1 對(duì)泛素化 HSPA8 水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 circRREB1 缺失的細(xì)胞中，泛素化 HSPA8 的水平顯著增加（圖 6O）。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們闡明了 circRREB1 可以靶向 HSPA8 并通過(guò)控制其泛素化來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)。我們進(jìn)行了分子對(duì)接預(yù)測(cè)和共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，以確定 HSPA8 是否直接與 PINK1 結(jié)合，結(jié)果表明 HSPA8 可以直接與 PINK1 結(jié)合（圖 6P、Q）。

圖6.circRREB1與HSPA8蛋白結(jié)合，抑制其泛素化和降解

7.circRREB1 通過(guò) HSPA8 調(diào)節(jié) PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)展

   我們之前的研究表明，circRREB1 能夠靶向并調(diào)節(jié) HSPA8 蛋白的表達(dá)，而 HSPA8 能夠直接與 PINK1 結(jié)合。我們?cè)O(shè)計(jì)了拯救實(shí)驗(yàn)，以探究 circRREB1 是否通過(guò) HSPA8 來(lái)調(diào)節(jié) PINK1 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬來(lái)促進(jìn)肺癌的發(fā)展。我們通過(guò)沉默 circRREB1 并同時(shí)過(guò)表達(dá) HSPA8 來(lái)檢測(cè)與 PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)。WB 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，HSPA8 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了因沉默 circRREB1 而導(dǎo)致的線粒體自噬相關(guān)蛋白質(zhì) PINK1、Parkin 和 LC3 表達(dá)的降低（圖 7A，補(bǔ)充圖 S4H-J）。

   隨后，我們抑制了 circRREB1 的表達(dá)，同時(shí)過(guò)量表達(dá) PINK1，并進(jìn)行了一系列功能測(cè)試，以探究 circRREB1 通過(guò) PINK1 促進(jìn)肺癌發(fā)展的能力。首先，我們通過(guò)檢測(cè)線粒體與溶酶體的共定位來(lái)測(cè)定細(xì)胞中的線粒體自噬水平。結(jié)果表明，PINK1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由 circRREB1 滅活所引起的線粒體自噬減少現(xiàn)象（圖 7B，補(bǔ)充圖 S4K）。我們進(jìn)行了 EdU 檢測(cè)以檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，并發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá) PINK1 逆轉(zhuǎn)了由 circRREB1 滅活所引起的細(xì)胞增殖能力下降（圖 7C，D）。我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明 PINK1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由 circRREB1 滅活所引起的細(xì)胞凋亡增加（圖 7E，F(xiàn)）。我們進(jìn)行了 Transwell 檢測(cè)以檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，結(jié)果表明 PINK1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由 circRREB1 滅活所引起的細(xì)胞遷移能力下降（圖 7G，補(bǔ)充圖 S4L）?？傊琧ircRREB1 可通過(guò)靶向 HSPA8 增加 PINK1 的表達(dá)水平，從而引發(fā)線粒體自噬，并最終促進(jìn)肺癌的發(fā)展（圖 7H）。

圖7.circRREB1 通過(guò)HSPA8 調(diào)節(jié) PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)展

結(jié)論

   這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，circRREB1上存在m5C修飾，并表明m5C修飾的circRREB1能夠誘導(dǎo)線粒體自噬，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)不僅為進(jìn)一步探究肺癌發(fā)展背后的機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為肺癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Cai D, Chen X, Xu H, Zhao Q, Zhou X, Wu J, Yuan S, Gao Y, Li D, Zhang R, Peng W, Li G, Nan A. m5C-modified circRREB1 promotes lung cancer progression by inducing mitophagy. J Exp Clin Cancer Res. 2025 Jul 14;44(1):203. doi: 10.1186/s13046-025-03460-1. PMID: 40653497; PMCID: PMC12257754.