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2型免疫反應是機體抵御寄生蟲感染的重要防御機制，但過度的2型免疫反應會引發(fā)一系列病理性變應性疾病，如哮喘、食物過敏和特應性皮炎。該反應起始于上皮細胞釋放的警報素（Alarmins），包括胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（TSLP）、白細胞介素-25（IL-25）和IL-33。這些因子觸發(fā)級聯(lián)反應，最終釋放標志性的2型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13(4)。這些細胞因子激活嗜酸性粒細胞、肥大細胞、第2組固有淋巴細胞（ILC2s）和輔助性T細胞2（TH2細胞），共同介導以粘液過度分泌、組織重塑和過敏性炎癥為特征的2型免疫應答(5-7)。靶向IL-4/IL-13和TSLP的生物制劑在多種2型過敏性疾病中的臨床應用及療效，進一步證實了這些細胞因子的過度產(chǎn)生與疾病發(fā)生的內(nèi)在關聯(lián)。然而，調(diào)控2型免疫反應失調(diào)的內(nèi)在細胞與分子機制，特別是其穩(wěn)態(tài)抑制機制，尚未完全闡明。在此，研究人員揭示了腸道絨毛細胞，一種以觸發(fā)2型免疫激活而聞名的特殊上皮細胞，還具有抑制2型反應的分子回路。在絨毛細胞中敲除轉(zhuǎn)錄因子Spi-B即足以引發(fā)自發(fā)性2型炎癥。絨毛細胞內(nèi)源性缺乏Spi-B使原本對食物過敏模型具有抵抗力的C57BL/6J小鼠變得易感。Spi-B抑制了由c-Kit信號驅(qū)動的絨毛細胞產(chǎn)生2型警報素TSLP。破壞這一負調(diào)控軸會導致絨毛細胞增生，并加劇2型炎癥，這可以通過酪氨酸激酶抑制劑進行藥物靶向治療。這些發(fā)現(xiàn)確定了2型免疫反應中以絨毛細胞為中心的關鍵檢查點，并突出了絨毛細胞在促進和抑制2型反應中的雙重作用。本文于2025年7月發(fā)表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF 52.7。

技術路線

主要實驗結(jié)果：

1. 轉(zhuǎn)錄因子Spi-B的缺失可誘發(fā)小腸簇細胞過度增生及自發(fā)性2型炎癥

為探究小腸簇細胞的內(nèi)在調(diào)控機制，我們對野生型（WT）小鼠經(jīng)流式分選獲得的上皮細胞黏附分子陽性（EpCAM+）SiglecF+簇細胞進行了RNA-seq分析。在簇細胞的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因中，編碼Ets家族轉(zhuǎn)錄因子Spi-B的Spib基因呈現(xiàn)為簇細胞內(nèi)表達水平最高且最具特異性的轉(zhuǎn)錄本之一（圖1A）。對已發(fā)表的小腸上皮細胞（IECs）scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析進一步證實：Spib在簇細胞群體中呈現(xiàn)優(yōu)勢性高表達，其表達水平甚至超過公認的簇細胞主調(diào)控因子基因Pou2f3（圖1B）。重新分析已公開的RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，Spib在多種小鼠組織的簇細胞中均保持持續(xù)高表達。為驗證上述發(fā)現(xiàn)，我們通過小鼠小腸組織的免疫熒光染色原位檢測Spi-B表達。共聚焦顯微鏡分析表明，無論是否感染蠕蟲Heligmosomoides polygyrus，Spi-B均與簇細胞標志物雙皮質(zhì)素樣激酶1（DCLK1）存在共定位（圖1C）。綜上，這些發(fā)現(xiàn)凸顯了Spi-B作為一種高度特異性于杯狀細胞的標志性轉(zhuǎn)錄因子的重要性。

圖1.上皮Spi-B缺失會導致腸道黏膜自發(fā)性出現(xiàn)2型炎癥

為闡明Spi-B在簇細胞中的作用，我們構建了Spibfl/flVillin-Cre小鼠（下文簡稱SpibΔIEC），實現(xiàn)腸道上皮細胞（IECs）特異性Spib基因缺失。Spi-B缺失導致簇細胞數(shù)量與比例顯著增加，穩(wěn)態(tài)條件下較同窩對照小鼠升高3-6倍（圖1D-E）。同時，Spib缺陷小鼠的杯狀細胞數(shù)量及黏液分泌同步增加，但腸道絨毛整體結(jié)構及其他上皮細胞亞群（如潘氏細胞、增殖細胞）基本無變化。5-溴-2′-脫氧尿苷（BrdU）示蹤實驗證實Spib缺失不影響IECs整體增殖。此外，掃描電鏡分析未檢測到三毛滴蟲定植跡象，表明表型與原生動物感染無關。

為了全面評估Spi-B缺失所導致的轉(zhuǎn)錄變化，我們對來自未感染的SpibΔIEC小鼠和對照小鼠的小腸組織進行大規(guī)模RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)：SpibΔIEC小鼠中簇細胞特異性基因（如Dclk1、Trpm5）及蠕蟲感染相關轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)（圖1F）。抗蠕蟲基因（如Pla2g4c、Gsdmc2）的上調(diào)促使我們比較SpibΔIEC小鼠與感染Heligmosomoides polygyrus蠕蟲14天（dpi）的野生型（WT）小鼠表達譜。Spib缺陷小鼠中大多數(shù)上調(diào)基因呈現(xiàn)與蠕蟲感染誘導基因高度相似的表達模式（圖1G）。基因集富集分析（GSEA）進一步顯示，Spib缺陷小鼠中tuft-1與tuft-2細胞群均顯著富集，其中tuft-2細胞富集程度更高。以上表明：Spib缺失可誘導抗蠕蟲基因程序表達，形成“類蠕蟲感染”轉(zhuǎn)錄譜，即使在沒有蠕蟲的情況下也是如此。

為驗證Spi-B缺失是否導致功能表型模擬，我們檢測蠕蟲感染效應分子表達：Spib缺陷小鼠IECs中Sprr2a、Gsdmc2和Retnlb顯著上調(diào)（圖1H），這些基因在蠕蟲感染中強誘導。其中Gasdermin C（Gsdmc）與抵抗素樣分子β（RELMβ）在蠕蟲感染中高表達，分別介導IL-33釋放和蠕蟲排出。與轉(zhuǎn)錄水平一致，SpibΔIEC小鼠小腸Gsdmc與RELMβ蛋白表達同步升高（圖1I-J），提示出現(xiàn)了活躍的2型免疫應答。除簇細胞擴增和上皮重塑外，SpibΔIEC小鼠還表現(xiàn)出小腸長度增加與肌層增厚（圖1K-L），此表型與蠕蟲感染后簇細胞增生特征一致。綜上，Spi-B缺失可誘發(fā)自發(fā)性2型炎癥狀態(tài)，其特征為簇細胞增生、抗蠕蟲效應分子上調(diào)和類蠕蟲感染的腸道重塑，證實Spi-B在抑制過度2型炎癥中的關鍵作用。

2. 簇細胞固有的Spi-B可抑制蠕蟲及食物過敏原誘導的2型應答

為明確Spi-B在簇細胞中的固有功能，我們構建并驗證了他莫昔芬誘導型Spibfl/flPou2f3-CreERT2小鼠（圖2A-B，下文簡稱SpibΔTuft）。盡管SpibΔIEC小鼠出現(xiàn)預期微皺褶細胞（M細胞）缺失，SpibΔTuft小鼠仍維持正常M細胞發(fā)育，證實簇細胞特異性Spib缺失。與SpibΔIEC表型一致，簇細胞特異性Spi-B缺失在穩(wěn)態(tài)下導致簇細胞增生（經(jīng)Dclk1與綠色熒光蛋白（GFP）標記Pou2f3共染色證實）（圖2C-D）。伴隨簇細胞數(shù)量/頻率增加，SpibΔTuft小鼠較同窩對照呈現(xiàn)小腸延長與肌層增厚（圖2E-G）。上述表型重現(xiàn)證實：Spi-B以簇細胞固有方式限制其過度擴增并維持組織穩(wěn)態(tài)。

圖2. 簇細胞固有Spi-B抑制簇細胞過度擴增并調(diào)控抗蠕蟲感染與食物過敏原的2型免疫應答

為驗證穩(wěn)態(tài)下觀察到的差異是否影響宿主對2型刺激的應答，我們對SpibΔTuft小鼠及對照進行Heligmosomoides polygyrus幼蟲感染（圖2H）。與Spi-B充足對照組相比，SpibΔTuft小鼠表現(xiàn)出蟲荷與蟲卵負荷同步下降，提示抗蠕蟲感染能力增強（圖2I）。一致地，SpibΔIEC小鼠也顯示更強的蠕蟲防御能力，具體表現(xiàn)為蟲荷減少、產(chǎn)卵量下降、杯狀細胞數(shù)量增加及黏液分泌增多（圖2J）。

除抗蠕蟲免疫外，2型免疫應答在影響全球10%人群的食物過敏發(fā)病機制中起核心作用。為評估Spi-B缺失對食物過敏原易感性的影響，我們采用花生提取物（PE）建立食物過敏模型（圖2K）。在通常具有抵抗力的C57BL/6J背景下，SpibΔTuft小鼠表現(xiàn)出核心體溫下降及低體溫發(fā)生率上升，表明對食物過敏原致敏的敏感性增強（圖2L）。膳食抗原引發(fā)的過敏反應源于肥大細胞擴增與活化，其標志是肥大細胞蛋白酶-1（Mcpt1）水平升高。經(jīng)PE再次激發(fā)后，SpibΔTuft小鼠較對照組呈現(xiàn)：上皮內(nèi)Mcpt1+肥大細胞數(shù)量增加、血清Mcpt1濃度升高以及花生特異性免疫球蛋白E（IgE）水平上升（圖2M-O）。過敏原激發(fā)后還觀察到肥大細胞與嗜酸性粒細胞比例增加。綜上表明：簇細胞固有Spi-B通過抑制蠕蟲感染與食物過敏原引發(fā)的過度2型免疫應答，維持免疫穩(wěn)態(tài)。

3. 簇細胞固有Spi-B通過調(diào)控TH2細胞應答抑制2型免疫

為闡明Spi-B缺失驅(qū)動自發(fā)性2型免疫的機制，我們在小腸類器官中發(fā)現(xiàn)：無論是否存在IL-4，Spi-B缺失均不影響簇細胞分化，表明Spi-B不直接調(diào)控腸干細胞向簇細胞的譜系定向。隨后通過固有層（LP）免疫細胞區(qū)室免疫表型分析探究簇-免疫細胞互作。結(jié)果顯示：嗜酸性粒細胞、巨噬細胞及樹突細胞等先天免疫細胞群比例無顯著變化；SpibΔIEC小鼠與對照組的ILC2s比例及其IL-13分泌水平亦相當，提示ILC2s在Spib缺失背景下貢獻有限。

在小腸固有層CD4+ T輔助細胞亞群中，SpibΔIEC小鼠呈現(xiàn)明顯的TH2表型極化（圖3A-B）。與對照相比，其GATA3+ TH2細胞比例與數(shù)量增加，而RORγt+ TH17細胞頻率降低（圖3B-C）。細胞因子檢測進一步顯示：Spib缺陷小鼠TH2細胞的IL-13分泌增加，但IL-4分泌未變（圖3D）。在SpibΔTuft小鼠中也觀察到TH2細胞豐度與IL-13分泌增強（圖3E-F），證實Spi-B以簇細胞固有方式調(diào)控TH2應答。信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）作為IL-13信號激活的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，可驅(qū)動腸上皮簇細胞增生。與TH2細胞IL-13分泌增加一致，免疫染色顯示SpibΔIEC小鼠上皮細胞內(nèi)STAT6酪氨酸磷酸化水平升高（圖3G-H）。

圖3. Spi-B通過調(diào)控TH2細胞應答抑制腸道簇細胞擴增

為闡明適應性免疫細胞的作用，我們構建了Rag1?/? SpibΔIEC小鼠。Rag1缺失可消除SpibΔIEC小鼠的自發(fā)性2型炎癥表型，包括簇細胞增生、上皮重塑及平滑肌增厚（圖3I-J）。此外，IL-13中和抗體處理能消除SpibΔIEC小鼠的簇細胞增生（圖3K-L），表明過量IL-13是Spi-B缺失誘導簇細胞增生的關鍵驅(qū)動因子。綜上證明：Spi-B通過限制TH2細胞豐度及反應性，內(nèi)在調(diào)控簇細胞擴增。

4. 簇細胞源性TSLP驅(qū)動Spi-B缺失誘導的簇細胞增生

為探究Spi-B調(diào)控TH2活性及簇細胞增生的內(nèi)在機制，我們對分選的野生型（SpibWT）與SpibΔIEC小鼠簇細胞進行批量RNA測序（圖4A）。警報素細胞因子基因Tslp在Spib缺陷簇細胞中上調(diào)最顯著（圖4A）。多組獨立實驗證實：SpibΔIEC與SpibΔTuft小鼠簇細胞的Tslp mRNA表達量較對照組升高6-8倍，而另一警報素Il25表達不變（圖4B-C）。小腸分泌性TSLP蛋白水平在Spib缺陷小鼠中同步升高（圖4D-E）。單分子熒光原位雜交（smFISH）顯示Tslp轉(zhuǎn)錄本特異性富集于Spib缺陷簇細胞，證實其為TSLP升高的主要來源（圖4F-G）。

圖4. 簇細胞源性TSLP參與Spi-B缺失觸發(fā)的簇細胞擴增

鑒于TSLP的強效2型免疫誘導能力，我們進一步驗證其功能貢獻：給予TSLP中和抗體可消除Spib缺陷小鼠的簇細胞數(shù)量增加、TH2細胞比例升高、STAT6活化及RELMβ產(chǎn)生（圖4H-L），證實TSLP在該自發(fā)性2型應答中不可或缺。雖然ILC2s高表達Il17rb，但TH2細胞呈現(xiàn)更高TSLP受體（TSLPR，由Crlf2編碼）水平。為探究CD4+ T細胞TSLPR在簇細胞增生中的作用，我們將CRISPR-Cas9體外編輯的Crlf2缺陷型或?qū)φ誄D4+ T細胞過繼移植至Rag1?/?SpibΔIEC小鼠（圖5A）。盡管固有層CD4+ T細胞比例相似，但接受sgCrlf2 CD4+ T細胞的小鼠表現(xiàn)出簇細胞數(shù)量減少、TH2細胞頻率降低及Retnlb表達下降（圖5B-C），證明CD4+ T細胞的TSLPR促進Spi-B缺失誘導的2型炎癥。此外，廣譜抗生素處理可消除Spib缺陷小鼠的簇細胞增生，提示微生物群在此條件下參與簇細胞擴增。

圖5. 簇細胞源性TSLP促進Spi-B缺陷小鼠的CD4+ T細胞依賴性簇細胞增生及過敏應答

為驗證TSLP升高是否介導SpibΔTuft小鼠的食物過敏癥狀，TSLP阻斷處理有效阻止了特征性體溫下降并降低血清Mcpt1與IgE水平（圖5D-G）。綜上表明：Spi-B在穩(wěn)態(tài)下抑制簇細胞TSLP產(chǎn)生，其缺失導致的簇細胞源性TSLP升高驅(qū)動簇細胞增生。

5. 簇細胞Spi-B對Kit的轉(zhuǎn)錄抑制

為解析TSLP抑制機制，我們采用靶向切割與轉(zhuǎn)座酶技術（CUT&Tag）分析簇細胞Spi-B-DNA互作（圖6A）。Spi-B結(jié)合峰廣泛分布于基因組各區(qū)域（圖6B）。整合Spi-B CUT&Tag啟動子結(jié)合位點與RNA-seq上調(diào)基因（圖4A），鑒定出22個重疊基因（圖6C）。其中Kit在Spib缺陷簇細胞中上調(diào)最顯著。CUT&Tag顯示：Spi-B在野生型簇細胞中直接結(jié)合Kit啟動子，該結(jié)合在缺陷細胞中消失（圖6D）；而Tslp、Il25等基因調(diào)控區(qū)無特異性結(jié)合。SpibΔIEC與SpibΔTuft小鼠中均證實Kit/c-Kit在mRNA與蛋白水平表達升高，且c-Kit高表達簇細胞比例增加（圖6E-H）。為明確c-Kit升高是否為上皮細胞自主現(xiàn)象，小腸類器官實驗顯示：無免疫細胞存在時，Spib缺陷簇細胞仍呈現(xiàn)c-Kit上調(diào)（圖6I）。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實Spi-B以劑量依賴方式轉(zhuǎn)錄抑制Kit啟動子，且該抑制依賴其完整的反式激活與DNA結(jié)合域（圖6J）。

圖6. Spi-B在簇細胞內(nèi)源性抑制Kit表達

伴隨c-Kit表達增強，Spib缺陷簇細胞中STAT5磷酸化水平（c-Kit信號標志）升高（圖6K）。STAT5在小腸上皮細胞中結(jié)合內(nèi)源性Tslp基因座的預測增強子與啟動子區(qū)（非基因體區(qū)）（圖6L）。在CMT-93上皮細胞中表達組成型活化STAT5（CA-STAT5）可增加Tslp轉(zhuǎn)錄（圖6M），提示c-Kit-STAT5信號轉(zhuǎn)錄驅(qū)動TSLP表達。為驗證c-Kit信號對TSLP誘導及簇細胞增生的必要性，采用c-Kit抑制劑ISCK03（強效選擇性抑制劑）進行藥理學干預，可有效緩解Spib缺陷小鼠的簇細胞增生、Tslp表達、TH2細胞比例及IL-13分泌（圖6N-P）。蠕蟲感染與食物過敏模型中，簇細胞呈現(xiàn)Spib下調(diào)伴隨c-Kit與Tslp升高，表明該通路在此類條件下被激活。綜上揭示：Spi-B作為Kit轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過限制c-Kit表達抑制TSLP產(chǎn)生。

6. 簇細胞固有Spi-B-Kit-TSLP回路調(diào)控腸道2型免疫

為明確c-Kit在簇細胞中的功能，我們構建并驗證Kitfl/flPou2f3-CreERT2（KitΔTuft）小鼠，進一步與Spibfl/fl雜交獲得簇細胞特異性雙敲除（SpibΔTuftKitΔTuft）小鼠。他莫昔芬誘導基因缺失后，雙敲除小鼠較SpibΔTuft小鼠表現(xiàn)出絨毛內(nèi)簇細胞數(shù)量與頻率降低（圖7A-C）。Kit缺失導致類器官簇細胞STAT5磷酸化減弱，體內(nèi)外Tslp表達下降及TH2細胞比例減少（圖7D-E），證實c-Kit是Tslp表達與TH2介導2型免疫病理的上游調(diào)控因子。表型上，簇細胞c-Kit缺失削弱SpibΔTuft小鼠的抗蠕蟲防御增強效應，表現(xiàn)為蟲卵負荷增加與上皮Retnlb表達降低（圖7F）。同時c-Kit缺失改善食物過敏表型：核心體溫回升、血清Mcpt1下降及肥大細胞擴增減弱（圖7G-H）。上述發(fā)現(xiàn)共同證明：簇細胞固有Spi-B-Kit-TSLP軸對維持簇細胞穩(wěn)態(tài)及應答激活刺激后的2型免疫至關重要。

圖7. 簇細胞固有Spi-B通過限制c-Kit-TSLP軸抑制2型免疫

為探索靶向c-Kit過度活化在食物過敏中的治療潛力，我們使用FDA批準酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼（Gleevec）（圖7I）。與機制研究選用ISCK03不同（圖6N），伊馬替尼因其成熟的臨床應用及治療c-Kit依賴性疾?。ㄈ缏运柘蛋籽。┑陌踩员贿x為治療模型。伊馬替尼處理顯著減輕SpibΔTuft與野生型小鼠的食物過敏反應發(fā)展與嚴重程度，表現(xiàn)為體溫恢復及血清Mcpt1降低（圖7J-K）。靶向c-Kit通路是潛在的過敏治療策略。

Spi-B缺失背景下，TSLP上調(diào)與2型應答過度活化至少部分由c-Kit信號介導。c-Kit作為受體酪氨酸激酶，在造血干細胞與肥大細胞等增殖分化中起關鍵作用。腸道中c-Kit功能見于腸干細胞、潘氏細胞與杯狀細胞，但其在簇細胞中的作用未知?？赡芤蛞吧痛丶毎鹀-Kit基礎表達極低導致研究缺失。進一步遺傳學剔除該低水平c-Kit未引起簇細胞豐度與功能的顯著改變（圖7C-D）。簇細胞低c-Kit表達非被動事件，而是Spi-B主動轉(zhuǎn)錄抑制的結(jié)果。該抑制解除后，c-Kit高表達驅(qū)動TSLP介導的簇細胞增生，甚至使C57BL/6J小鼠對食入性過敏原易感。食物過敏中簇細胞Spib下調(diào)伴隨c-Kit與Tslp升高支持該通路的臨床相關性。使用臨床藥物伊馬替尼抑制c-Kit過度活化可緩解過敏病理發(fā)展。但鑒于c-Kit在肥大細胞等廣泛表達，且伊馬替尼對其他酪氨酸激酶有抑制效應，c-Kit在簇細胞中的精確作用及治療潛力需進一步研究。本研究為靶向簇細胞區(qū)室、調(diào)控Spi-B-Kit-TSLP軸以恢復免疫穩(wěn)態(tài)和改善2型病理提供了機制框架。

參考文獻：

Wang J, Shen R, Yang K, Guo X, Yu J, Wu C, Guo XK, Hu X. Tuft cells restrain intestinal type 2 immunity through the transcription factor Spi-B. Sci Immunol. 2025 Jul 4;10(109):eads5818. doi: 10.1126/sciimmunol.ads5818. Epub 2025 Jul 4. PMID: 40614214.